Los marcadores microsatélites o SSR

Los microsatélites se encuentran ampliamente distribuidos en los genomas de organismos eucariotas, y a nivel molecular corresponden a secuencias de 1 a 5 nucleótidos repetidas en tándem, en donde el número de repeticiones revela diferencias genéticas entre individuos. En general, el grado de polimorfismo revelado aumenta con la longitud total del SSR, y aunque un microsatélite no es específico de un locus, las regiones flanqueantes sí lo son, por lo que un par de partidores para estas regiones amplificará un microsatélite concreto26,79.

Los microsatélites o SSRs son marcadores moleculares que han sido usados con éxito para varios propósitos desde el fitomejoramiento hasta la evaluación de poblaciones orientada a la conservación80 en una multitud de especies vegetales, muchas de ellas de importancia comercial79. El valor de los microsatélites reside en su condición altamente polimórfica, su naturaleza codominante, su abundancia dentro del genoma, su detección sencilla por PCR, cobertura extensa del genoma y su requerimiento de una pequeña cantidad de ADN para el análisis79. El carácter hipervariable de los SSRs permite discriminar eficazmente entre individuos estrechamente relacionados, lo cual es de utilidad para la identificación de cultivares81.

Los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSR) son regiones de secuencias pequeñas (dos a 10 pares de bases) repetidas, arregladas en serie, las cuales se asume que están distribuidas azarosamente por todo el ADN. Son secuencias de ADN altamente variables dispersas a través de los genomas de hongos, plantas y animales, los cuales pueden o no estar asociadas con genes, son loci altamente mutables que pueden estar presentes en muchos sitios del genoma. Dado que, la repetición por sí misma no codifica para formar ninguna proteína, y debido a que las secuencias de ADN repetitivo pueden recombinarse y expandirse más frecuentemente que otros tipos de secuencias, estas regiones son a menudo altamente variables y consecuentemente útiles para medir el polimorfismo entre especies o variedades muy relacionadas78.

Figura 5. Microsatélites, ejemplo de un di-nucleótido A-C(n) Fuente: Aranguren-Méndez et al., (2005)134

Los tipos de repeticiones que ocurren en los SSR varían entre las especies. Las repeticiones más frecuentes en las plantas son (AA)n y (AT)n. Estas repeticiones están concentradas en secciones grandes del ADN que no codifican para genes conocidos y que se han llamado macrosatélites, por lo que probablemente no son útiles como aquellos marcadores que están distribuidos al azar. Las secuencias (GA)n y (GT)n y sus complementos (CT)n y (CA)n se presentan con más frecuencia y están aleatoriamente espaciadas en el genoma de maíz. También observaron que estos loci son altamente polimórficos entre variedades de arroz, por lo que son útiles como herramientas de mapeo y para estudios de polimorfismos intraespecíficos. Los SSRs representan un nivel adicional de información genómica que se puede usar para los estudios de mapeo y para la determinación de polimorfismos78.

Una vez localizados tales secuencias cortas de ADN, que son frecuentes en el genoma, se secuencian las zonas que las flanquean y se construyen, a partir de estas, cebadores que debido a los extremos serán de secuencia única, y debido al fragmento repetido entre ellos, podrán aparearse a numerosos puntos del genoma, generando innumerables loci. Los alelos de un mismo locus son secuencias con distinto número de copias del motivo (GA, CAC, ATC, etc.) repetido; la combinación de numerosos loci con innumerables alelos hace que el total de microsatélites sea ilimitado. El número de polimorfismos a que dan lugar es muy elevado con ventajas sobre RAPD y AFLP: son codominantes, de alta reproducibilidad y dan lugar a puntos fijos de mapa. Son ideales para la identificación varietal111. Los marcadores moleculares corresponden a regiones del ADN que muestran polimorfismo o variación entre diferentes individuos dentro de una especie. El análisis de ADN presenta múltiples ventajas, por entregar información genética precisa, permitir el análisis simultáneo de un gran número de muestras y es independiente del medio ambiente, además pueden ser utilizados en cualquier fase de desarrollo de la planta. Por otro lado, el ADN puede ser extraído a partir de cantidades ínfimas de tejido de cualquier órgano somático y estado de desarrollo de la planta, permitiendo la obtención de resultados en un corto plazo29, 66. Los microsatélites o SSR, fueron reportados como un sistema

de marcadores en combinación con el PCR, por primera vez en 1989, se determinó que los microsatélites representan el 3% del genoma. Estos marcadores son iteraciones de un motivo nucleotídico de 1 a 6 bp (pares de bases). Las repeticiones mono-, di-, tri- y tetranucleotídicas son las más comunes, mientras que las repeticiones penta- y hexanucleótídicas son las de menor frecuencia. Posteriormente, búsquedas en bancos de datos de secuencias publicadas de ADN de plantas revelaron que los sitios de microsatélites están ampliamente distribuidos con una frecuencia de uno cada 50 mil pares de bases. Los marcadores SSR son usados como un efectivo método de tipificación genética gracias a su abundancia y distribución en el genoma, herencia codominante, elevada tasa de mutación, sumados a su alta reproducibilidad en comparación con otros marcadores moleculares, su fácil detección, por requerir procedimientos técnicos simples repetibles y su potencial para la automatización. Sus aplicaciones abarcan estudios de ADN ancestral y forense, genética de poblaciones y también de conservación y manejo de recursos biológicos, como es el caso de identificación de individuos, análisis de identidad genética, estudios de diversidad y estructura genética, ubicación de genes o complejos de genes deseables y la ubicación física de una secuencia de ADN de interés en el mapa cromosómico de una accesión determinada con fines de mejoramiento23, 28, 59, 107.

Figura 6. Motivos repetitivos y polimorfismo de los Microsatélites o SSR25. Fuente: Ponce et al., (2013)25

El desarrollo de marcadores SSR es muy laborioso debido a que deben identificarse y secuenciarse regiones genómicas concretas (bordes del microsatélite), aunque una vez conseguido presenta un sistema muy informativo. Al respecto, Cervera et al. (2002)74 mencionan que aunque

los microsatélites permiten analizar sólo un locus por experimento son bastante informativos ya que dejan diferenciar las variantes alélicas de los loci analizados y por lo tanto identificar grupos de ligamiento entre diferentes mapas genéticos. Sin embargo, para su desarrollo se precisa conocer la secuencia y, por lo tanto, son menos numerosos que otros marcadores dominantes. Estos marcadores son ideales para el estudio de ligamiento genético en plantas y el mapeo físico, los estudios poblacionales y la identificación de variedades78.

Los análisis con marcadores genéticos del tipo microsatélite para el estudio de poblaciones resultan muy útiles y valiosos, ya que además de la evaluación de la variabilidad genética, la información generada permite estudiar con mayor exactitud la estructura genética y la caracterización molecular de las poblaciones y/o razas. Así mismo, los microsatélites pueden ser usados eficazmente para establecer las relaciones genéticas entre poblaciones y razas, de gran utilidad en la evaluación global de la diversidad (dentro y entre razas), que es sumamente útil y debería ser tomada en cuenta a la hora de tomar decisiones para poner en práctica planes de conservación y mejoramiento134.