3.3.1 Ensayo General
El ensayo de actividad de la tripanotión reductasa está basado en el descrito por Hamilton, incorporando algunas modificaciones propias que se describen a continuación. La innovación más relevante consistió en la inclusión de NADP+ en la reacción (245). Fue
importante establecer las condiciones óptimas de almacenamiento de los reactivos utilizados en el ensayo con el fin de conservar la reproducibilidad de los datos, por lo que estos se almacenaron en los volúmenes adecuados según la cantidad que se esperaba emplear y a concentraciones elevadas, cercanas a su límite de solubilidad a -20ºC. Estas alícuotas una vez descongeladas y utilizadas son descartadas (Tabla 3.3).
REACTIVO CONCENTRACIÓN
HEPES 2M pH 7.5
EDTA 400 mM
NADP+ 15 mM (Preparado en HEPES 40 mM)
DTNB 10 mM (Preparado en HEPES 40 mM)
NADPH 15 mM (Preparado en HEPES 40 mM)
Péptidos o Moléculas 5 mM (Preparadas en DMSO)
TS2 10 mM (Preparado en HEPES 40 mM)
Tabla 3.3 | Concentraciones de almacenamiento de las soluciones madres empleadas para realizar los ensayos de actividad. Estas son mantenidas a -20 ºC y, una vez descongeladas, son descartadas.
El ensayo se realizó a unas concentraciones finales de 40 mM de HEPES, 1 mM de EDTA,
30 µM de NADP+, 150 µM de NADPH, 25 µM de DTNB, 1 µM de TS
HF. La reacción se inició con una solución de TS2/NADPH, con la que se alcanzó un
volumen final en el pocillo de reacción de 250 µL. Los datos de actividad se recolectaron cada 30 s a 412 nm empleando un espectrofotómetro VersaMAX de Molecular Devices (Sunnyvale, California, EEUU). Las pendientes de las curvas de reacción se calcularon empleando la aplicación de hojas de cálculo Excel 2010-2016 de Microsoft Corporation (Redmond, Washington, EEUU).
El ensayo general se realizó por triplicado empleando el péptido o molécula a evaluar a una concentración final de 25 µM. Como control positivo se empleó mepacrina.
Los demás ensayos de actividad de la TryR son variaciones de ensayo general y sus particularidades se describen en los apartados siguientes.
3.3.2 Ensayo para calcular CI50
Las moléculas que mostraron actividad inhibitoria en un primer cribado a una única concentración de 25 µM se sometieron a un segundo ensayo con el fin de hallar su concentración inhibitoria 50 (CI50). La reacción fue similar a la ya descrita, con la única
diferencia de en este caso se utilizaron diversas concentraciones de inhibidor (75, 25, 8.3, 2.7, 0.9, 0.31, y 0.10 µM). Como control positivo se empleó mepacrina, cuya CI50 para esteensayo
es de 12 µM.
Debido a la naturaleza de nuestros datos, en los cuales se puede llegar a obtener un 100% de inhibición (0% de actividad), el cálculo de CI50 se realizó empleando un modelo absoluto en
lugar de uno relativo (4-parametros) (246). Sin embargo, la ecuación empleada para el cálculo absoluto, descrito por la Ecuación 1.14, no se encontraba disponible en el GraFit 6.0 por lo que fue necesario introducir la ecuación tal y como se describe en la Tabla 3.4.
y = 100 / (1 + exp(s * ln(abs(x/I)) ) )
Variablesx
Parámetros I, s
Debido a que se evaluaron concentraciones en un intervalo comprendido entre 75 µM y 100 nM, aquellas moléculas que no mostraron capacidad inhibitoria en el ensayo se reportan con una CI50 > 75µM.
3.3.3 Ensayo para calcular KM y VMAX.
Para calcular la KM se utilizaron diferentes concentraciones de TS2 en un intervalo
comprendido entre 0.1x y 10x el valor esperado de KM. Debido a las altas concentraciones
de sustrato empleado, la cantidad de TryR se redujo en un orden de magnitud respecto del ensayo general ya descrito, empleándose 0.7 nM de enzima en lugar de 7 nM. El intervalo de concentraciones de TS2 empleadas en la reacción osciló entre 100 µM y 1.56 µM. El resto de
reactivos de la reacción se emplearon a la misma concentración descrita en el ensayo general. Para el cálculo de la KM y la VMAXsegún los modelos de inhibición clásica se emplearon las
definiciones ya incluidas en GraFit para este propósito.
3.3.4 Ensayo para calcular KI
en la inhibición clásica.
Es importante tener en cuenta que en el ensayo de KI se utilizan diferentes concentraciones
del sustrato (TS2) (desde 0.1x hasta 10x el valor de KM) y diferentes concentraciones de
péptido (desde 0.1x hasta 10x el valor sospechado de KI). Debido a las altas concentraciones
de sustrato empleadas, la cantidad de la TryR se redujo en un orden de magnitud, empleándose 0.7 nM de enzima en lugar de 7 nM. Los intervalos de concentraciones de TS2
y de péptido empleadas en la reacción oscilaron entre 1.56 µM - 50 µM y 5 µM - 20 µM respectivamente. El resto de los reactivos de la reacción se mantuvo a las mismas concentraciones que las descritas para el ensayo general.
Para calcular la KIen la inhibición clásica se emplearon las definiciones ya incluidas en GraFit
para este propósito.
3.3.5 Ensayo para calcular Kobs y demás parámetros en la inhibición tiempo
dependiente.
Para la obtención de la Kobs y demásparámetros característicos de la inhibición tiempo
diferentes concentraciones de inhibidor comprendidas entre 16.6 µM y 68 nM para cada una de las diferentes concentraciones fijas de sustrato ensayadas (entre 3 µM y 375 nM).
El seguimiento de la actividad se realizó midiendo la absorbancia de la mezcla de reacción en un lector de placas EnSpire de Perkin-Elmer (Waltham, Massachusetts, EEUU) a 412 nm. Dada la gran relevancia de obtener una medida muy precisa de los valores de absorbancia en función del tiempo de reacción, se hizo uso del sistema de dispensación automática del equipo, lo que nos permitió realizar lecturas de manera inmediata tras el inicio, recolectándose para cada pocillo 999 lecturas. Los análisis de regresión no lineal fueron realizados utilizando el GraFit 6.0. Las expresiones de las ecuaciones utilizadas para los análisis, al no encontrarse incluidas en el paquete, fueron introducidas manualmente.
abs = vs*t + (Vi-Vs)/Kobs*(1-e^(-kobs*t))
Variables t Parámetros Vi, Vs, Kobs Constantes eTabla 3.5 | Definición en GraFit de la Ecuación 1.10 empleada para hallar la Kobs.
kobs=(K5*I/(kiapp+I))
VariablesI
Parámetros K5, kiapp
Tabla 3.6|Definición en GraFit de la Ecuación 1.14 empleada para hallar la KIApp a patir de la
Kobs.
Kiapp= (S+Km)/((Km/Ki)+(S/(a*Ki)))
Variables S Parámetros Ki, a Constantes KmTabla 3.7 |Definición en GraFit de la Ecuación 1.19 empleada para hallar la KI a partir de la
3.3.6 Inhibición de TryR en Lisados de Parásitos
La actividad de la TryR en lisados se evaluó de acuerdo al procedimiento descrito por Van den Bogaart (247). Para la preparación de los lisados, los parásitos fueron centrifugados y lavados 2 veces con PBS para finalmente ser resuspendidos a razón de 200 µl de tampón de lisis (HEPES 40 mM, Tris 50 mM pH 7.5, EDTA 1 mM y Triton X-100 al 2 %) por cada 12 x106 parásitos. La lisis se realizó durante 15 minutos a 26 ºC. Tras la lisis, la reacción fue
iniciada con una solución que contiene NADPH (Cf = 200 µM), DTNB (Cf = 25 µM), y TS2
(Cf = 75 µM), en un volumen final de reacción es de 200 µL. Los datos de actividad se
recolectaron cada 30 s a 412 nm empleando un espectrofotómetro VersaMAX de Molecular Devices (Sunnyvale, California, EEUU). Las pendientes de las curvas de reacción se calcularon empleando la aplicación de hojas de cálculo Excel 2010-2016 de Microsoft Corporation (Redmond, Washington, EEUU).