Modelos de inhibición tiempo-dependientes

Se pueden distinguir cuatro modos de interacción diferentes entre un inhibidor y una enzima que darían como resultado una cinética tiempo-dependiente. Los equilibrios relacionados en estos procesos se encuentran representados en la Figura 1.21

En la Figura 1.21 A se muestra el equilibrio característico de la reacción no inhibida. La constante k1 hace referencia a la constante de velocidad del proceso de unión del sustrato a

la enzima para formar el complejo ES. La constante k2 hace referencia a la constante de

velocidad del proceso de disociación del complejo ES a enzima libre y sustrato. kcat es la

Figura 1.21| Mecanismos de inhibición tiempo-dependientes. A. Reacción en ausencia de inhibidor, B. Unión lenta reversible simple, C. Isomerización enzimática y D. Inhibición dependiente de mecanismo (230).

La Figura 1.21 B ilustra el equilibrio en un proceso de inhibición simple reversible que conduce a una inhibición tiempo-dependiente debido a que tanto k3 como k4 presentan unos

bajos valores en comparación con kcat. Como con los inhibidores de unión rápida, la

constante del equilibrio de disociación KI viene dada por la Ecuación 1.8.

:_M = NO N_P =

Q <

Q< Ecuación 1.8

Según la Figura 1.21 C, la enzima encuentra al inhibidor y establece un equilibrio de unión que, al igual que en el Figura 1.21 B, sigue estando definido por las constantes k3 y k4. Sin

embargo, según este esquema, la unión del inhibidor induce un cambio conformacional en la enzima (isomerización) que conduce a un nuevo complejo enzima-inhibidor E*I. Las constantes de formación y disociación de este nuevo complejo están dadas por k5 y k6

respectivamente. La constante de disociación para el complejo inicial EI sigue estando dada por KI, pero una nueva constante de disociación para la segunda conformación de la enzima

debe de ser tenida en cuenta (KI*). Esta segunda constante de disociación viene dada por la Ecuación 1.9.

:_M∗ ₌ :MNS

N_F+ N_S =

Q <

Q< + Q∗_< Ecuación. 1.9

Para que todos estos equilibrios realmente den lugar a un proceso de inhibición tiempo- dependiente, KI* debe ser mucho menor que KI. Así, en esta situación la isomerización de la

enzima lleva a una unión mucho más fuerte entre la enzima y el inhibidor.

Hay que tener en cuenta que para observar un comportamiento de cinética de unión lenta no es suficiente con que la conversión de EI a E*I sea lenta. La reacción reversa debe ser lenta también. De hecho, para que la unión lenta sea detectada, la constante reversa (k6) debe

ser mucho más pequeña que la constante de isomerización (k5). En el caso extremo que k6<<k5, no será posible detectar el retorno a la conformación EI y el paso de isomerización

de la enzima parecerá conducir a una inhibición irreversible. Bajo estas condiciones k6 puede

ser considerada despreciable y la isomerización puede ser tratada como un paso irreversible dominado por la constante de velocidad k5.

Finalmente, en la Figura1.21 D se consideran dos modelos de interacción del inhibidor con la enzima para los cuales k6 es realmente igual a cero; es decir, se está produciendo una

inactivación irreversible de la enzima. En todos los esquemas inhibitorios tenidos en cuenta hasta ahora, incluso en el caso de la inhibición de unión fuerte y lenta, la k6 no es igual a cero.

Esta constante puede llegar a ser muy pequeña y por motivos prácticos ser considerada como una inhibición irreversible, pero, si se espera el tiempo suficiente y con la dilución adecuada del complejo EI, se puede recuperar de nuevo una población de enzima libre activa. En el caso de un inhibidor irreversible, la enzima que ha quedado unida al inhibidor queda permanentemente inactivada. Ningún periodo de tiempo y bajo ninguna dilución se podrá recuperar enzima libre activa tras la unión de este tipo de inhibidores. Tales inhibidores son conocidos como inactivadores enzimáticos (230).

El primer ejemplo de una inhibición irreversible es el proceso conocido como marcaje por afinidad (affinity labelling) o modificación covalente (covalent modification) de la enzima. En este caso, el inhibidor se une a la enzima y, de manera covalente, modifica uno o varios residuos catalíticos esenciales de la misma. La modificación covalente incluye una alteración química de la molécula inhibidora, pero el proceso está basado en una modificación química que ocurre en ausencia de la reacción catalítica. Los marcadores de afinidad son útiles no solo como inhibidores de la actividad enzimática sino también como herramientas valiosas en investigación. Algunos de estos compuestos son muy selectivos hacia residuos específicos por lo que pueden ser utilizados para identificar residuos importantes en los ciclos catalíticos de la enzima a la que inactivan (232,233).

La segunda forma de inactivación irreversible que debe ser tenida en cuenta es la inhibición basada en el mecanismo. En esta, la molécula inhibitoria se une al sitio activo de la enzima y es reconocida por esta segunda como un análogo del sustrato. El inhibidor es, de esta manera, modificado por la actividad catalítica de la enzima para formar un complejo E-I que habrá perdido su función catalítica de forma permanente. Muchos de estos inhibidores inactivan a la enzima al formar aductos E-I irreversibles. En otros casos, a pesar de que el inhibidor es posteriormente liberado de la enzima, esta queda permanente atrapada en un estado en el cual no puede realizar su actividad catalítica. Debido a que son químicamente alterados por el mecanismo de la catálisis enzimática en el sitio activo, los inhibidores basados en el mecanismo funcionan siempre como inactivadores competitivos. Según Copeland(229), este tipo de inhibidores cuentan con las siguientes 7 características: i) la inhibición se da de manera tiempo dependiente, ii) la cinética de inactivación es saturable, iii) el sustrato debe proteger contra la inactivación, iv) la inactivación debe ser irreversible, v) la estequiometría de inactivación debe de ser ≤1:1 con la enzima, vi) la inactivación requiere de la catálisis y vii) la inactivación debe ocurrir antes de que se libere la enzima en forma activa.