A modo de ejemplo en la Fig. 6.3 se presenta la gráfica de la dependencia de la actividad enzimática de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, una enzima que interviene de en el metabolismo de hidratos de carbono. Dicha gráfica fue obtenida preparando mezclas de reacción (en este caso 11 mezclas de reacción) de igual composición que son incubadas cada una de ellas a las temperaturas indicadas en la figura. Cada punto de la gráfica se obtiene de la evaluación a cada temperatura de la variación de la concentración de producto en función de tiempo (velocidad inicial y en este caso la Vmax). En este caso particular se graficó la actividad enzimática porcentual calculada respecto del valor de actividad enzimática hallada a 25ºC.
Es importante remarcar aquí que de esta gráfica no se define la temperatura óptima. De esta gráfica se puede definir la o las temperaturas a las que se detecta el valor más alto de Vmax. Para establecer la temperatura óptima se realizó un ensayo de estabilidad que implica, como hemos mencionado, incubar las mezclas de reacción sin sustrato a distintas temperaturas por un tiempo igual o el doble del empleado en el ensayo de actividad. Una vez finalizada la incubación de la enzima sin sustrato a cada temperatura, a la mezcla de reacción se le adiciona el sustrato y se incuba a la temperatura en que se detectó el valor más alto de Vmax que en este caso podría ser cualquier temperatura entre 25ºC y 32ºC. Los resultados obtenidos al hacer un experimento de estabilidad térmica como el descripto se muestran en la Fig 6.4. En esta figura se puede observar que cualquiera de las temperaturas entre 25ºC y 32ºC puede tomarse como temperaturas óptimas. También se observa en la gráfica que por encima de 35ºC la enzima se desnaturaliza y deja de ser funcional.
Fig 6.3. Dependencia de la actividad enzimática de la gliceraldheido 3 fosfato deshidrogenasa con la temperatura
% de ac tividad e n zimática r es p ecto de l va lo r ob te n ido a 25 ºC Temperatura (ºC)
Fig 6.4. Actividad remanente respecto de la actividad detectada a 25ºC luego de incubar el extracto enzimático durante
10 minutos a cada una de las temperaturas ensayadas.
Problemas
Problema 1
La fumarasa cataliza la deshidratación reversible del malato a fumarato: malato ⇄ fumarato + H2O
La energía de activación de la reacción es: Ea: 15.600 cal/mol.
a- ¿Cuál es el cambio de la constante de velocidad cuando se aumenta la temperatura de 25 a 35oC?
b- Sabiendo que el valor de la constante de velocidad a 25oC es k25 = 5.10-4 s-1, calcule el valor de la misma a 35oC.
c- Dibuje el perfil de energías a lo largo de la coordenada de reacción indicando a qué corresponde cada región de la curva.
Problema 2
a) Se encontró que la velocidad de la reacción de hidrólisis de las uniones α-14 de almidón, catalizada por la enzima alfa-amilasa, experimentaba un aumento de tres veces al pasar de 20 a 30oC. En base a estos datos calcule la energía de activación (Ea) de la reacción.
b) En presencia de ácido, la energía de activación para la reacción de hidrólisis es de 25.000 cal/mol. ¿Con cuál de los dos catalizadores será mayor el aumento de la velocidad inicial de reacción para un determinado aumento de temperatura? ¿Por qué?
Problema 3
Se midió la actividad de una enzima a diversos pH y se obtuvo la siguiente curva:
Temperatura (ºC) % d e act iv id ad en zi m á ti ca r esp ec to de l va lo r obt en id o a 25 ºC
vo
1 2 3 4 5 6 7 pH
a) ¿Cuáles serían los aminoácidos involucrados en el centro activo y cuál el estado de ionización requerido para obtener la máxima actividad?
b) Por exposición durante 5 minutos a pH 5,0, la enzima se inactiva en un 50%. Dibuje el gráfico comparativo de las curvas [P] en función del tiempo, para el pH óptimo y para pH 5,0. c) Dibuje la curva que obtendría al exponer la enzima 5 minutos a cada uno de los pH correspondientes a la curva I y luego medir su actividad a pH 4,0.
Problema 4
Se midió la actividad de la enzima monoaminooxidasa a diferentes pH y se obtuvieron los siguientes valores (en unidades relativas a la actividad a pH 7,0):
pH 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
actividad 100 150 200 215 30
a- Grafique actividad vs pH. ¿Cuál es el pH óptimo de esta enzima?
b- Luego de preincubar la enzima durante 5 minutos a cada uno de los pH indicados, se midió su actividad a pH 7,3 y se obtuvieron los siguientes valores:
pH de preincubación 8 9 10 11
actividad a pH 7,3 120 120 100 20
b- Grafique y explique estos resultados. Problema 6
La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la siguiente reacción:
COO- COO-
C=O +NADH + H+ HC-OH + NAD+
El mecanismo de reacción implica la transferencia coordinada de un H+ (proveniente del residuo His 195) y un H+ (proveniente de la coenzima NADH ) al piruvato. El sustrato se une luego de la unión enzima-coenzima.
A partir de diferentes líneas experimentales se llegó a los siguientes resultados:
a- En el caso en que la proteína se modificó, reemplazando el residuo Arg 109 por Gln, la reactividad química del piruvato unido se reduce drásticamente; la velocidad de transferencia del H+ se reduce a menos del 0,07% con respecto a la enzima nativa. En cambio, la afinidad de unión del piruvato se reduce mucho menos (5%) y la del NADH no sufre alteración.
b- Un residuo Asp 168 se encuentra cercano a la His 195. Su reemplazo por Ala o Asn causa una fuerte reducción de la velocidad de reacción.
c- El reemplazo de un residuo Arg 171 por Lys reduce la afinidad de la enzima por el sustrato al 0,05% con respecto a la unión con la enzima nativa. Asimismo, se modifica la especificidad de la unión E-S. Mientras la enzima nativa tiene KM = 0,05 mM y 2,00 mM para sustratos con cadenas de uno y dos carbonos, respectivamente, el mutante Lys tiene KM de 120 y 60 mM. d- El reemplazo de un residuo Ile 250 por Asn reduce la unión del NADH.
En base a estos resultados, prediga:
a- La localización posible de los residuos mencionados en la enzima nativa, en relación con el sustrato y el NADH.
b- ¿Cuál sería su función en la catálisis?
Bibliografía
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell. Dixon, M., Webb, E.C. (1980) Enzymes New York: Academic Press.
Fell D. (1996) Understanding the Control of Metabolism. Londres: Portland Press. Segel, I. H. (1975). Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.
Segel I.W. (1982) Cálculos de Bioquímica, 2da. edición. Zaragoza: Editorial Acribia.