Ensayo DPPH

Este ensayo mide la capacidad para captar radicales libres por medio de la capacidad que presentan los compuestos antioxidantes para atrapar el radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo

(DPPH•), convirtiéndolo a un producto sin color (Figura 3.3) (Brand-Williams et al., 1995).

El DPPH• es uno de los pocos radicales orgánicos nitrogenados estables y disponibles

comercialmente, por lo que no requiere ser generado previo al ensayo. Este radical tiene un espectro de absorción característico, con un máximo a 515 nm, y posee una coloración

púrpura intensa (Prior et al., 2005). Es muy soluble en medio orgánico, sin embargo

soluciones conteniendo hasta un 50 % de agua permiten utilizarlo para medir la capacidad

antioxidantes tanto de compuestos liposolubles como hidrosolubles (Stasko et al., 2007). La

reacción que tiene lugar en este ensayo es dependiente del pH (Foti et al., 2004) y la

disminución de la concentración del DPPH• es directamente proporcional a la concentración

de antioxidantes presentes en la muestra (Prior et al., 2005).

+ A. N N NO2 O2N O2N + AH N HN NO2 O2N O2N DPPH. DPPHH λmax=515nm

Capítulo 3

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Procedimiento. La metodología utilizada para este ensayo fue la descripta por Brand- Williams et al., (1995). Diariamente se preparó el reactivo de trabajo que consiste en una

solución 60 µM del DPPH•en metanol protegida de la luz.

Para la determinación de las muestras se colocaron 3 mL de reactivo de trabajo en un tubo de Khan y se añadieron 100 µL de muestra apropiadamente diluida. La mezcla obtenida se agitó en un vortex (Decalab, Argentina). Luego de 15 min de incubación a temperatura

ambiente y en oscuridad, se leyó la absorbancia de la solución a 515 nm (A1)contra un blanco

procesado de la misma forma (A0), en el cual la muestra fue reemplazada por el solvente de

dilución. Todas las muestras y los blancos fueron determinados por triplicado y se calculó la

absorbancia de cada muestra a través de la diferencia (ΔAbs) de A0 – A1.

La capacidad de captación de radicales libres de cada muestra se determinó

extrapolando su ΔAbs en una curva de calibración construída utilizando trolox como antioxidante. Esta curva de calibración se preparó diariamente. El rango de linealidad utilizado fue de 0,001 a 0,020 mM. Los estándares se procesaron por triplicado de la misma forma que las muestras.

Los resultados obtenidos para los extractos de uva y orujo se expresaron como milimoles equivalentes de trolox en 100 g de peso seco de muestra (mmol ET/ 100 g). En el caso de las fermentaciones alcohólicas y los vinos, los resultados se informaron como milimoles equivalentes de trolox en 1 L de muestra (mmol ET/ L).

3.2.4 Análisis Estadísticos de los datos

El análisis estadístico de los datos generados en este capítulo de la tesis se realizó mediante la utilización de los programas InfoStat (versión 2014p) y STATISTICA (versión 7.1).

3.2.4.1 Estadística Descriptiva

De acuerdo a la Sección 2.2.5.1 del CAPÍTULO 2, los valores obtenidos en las

diferentes determinaciones analíticas de este capítulo son expresados como la media ± desviación estándar.

Capítulo 3

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3.2.4.2 Estadística Inductiva- Análisis de la Varianza (ANOVA)

De acuerdo a la Sección 2.2.5.2 del CAPÍTULO 2, el ANOVA se aplicó a los valores

obtenidos en las determinaciones analíticas a fin de evaluar la variación entre variedades y entre tipo de muestras. En todos los casos, cuando el ANOVA indicó diferencias significativas (p < 0,05), la comparación de los valores medios de a pares se realizó empleando el método de comparaciones múltiples DGC.

3.2.4.3 Estadística Multivariada

3.2.4.3.1 Análisis de correlación simple de Pearson (ACSP)

El ACSP se realiza con el fin de obtener una medida de la magnitud y el tipo de asociación lineal entre dos variables. Coeficientes de correlación próximos a la unidad y positivos señalan un comportamiento similar entre las variables; por el contrario, si el coeficiente es negativo y próximo a la unidad indica un comportamiento opuesto entre dichas variables.

El ACSP se aplicó para estudiar la relación entre el contenido de polifenoles totales

(PT) y la CA in vitro, media por los ensayos FRAP, ABTS y DPPH en cada tipo de muestra

(uva, orujo, fermentación alcohólica y vino).

3.2.4.3.2 Análisis de Correlación Canónica (ACC)

Es una técnica que permite hacer un estudio cuantitativo de los datos debido a que permite determinar la relación lineal entre dos grupos de variables métricas, un grupo de variables independientes y otro grupo de variables dependientes. Este análisis provee una medida de correlación (L o correlación canónica) entre una combinación lineal de las variables en un conjunto (lX o variable canónica de X), con una combinación lineal de las

variables en el otro conjunto (lY o variable canónica de Y). En un primer paso el análisis

determina el par de combinaciones lineales con máxima correlación. En un segundo paso, identifica el par con máxima correlación entre todos los pares no correlacionados con el par de combinaciones seleccionadas en el primer paso y así sucesivamente.

El ACC se utilizó para evaluar la relación entre el perfil fenólico (agrupado por

familias de compuestos) y la CA medida por los ensayos in vitro (FRAP, ABTS y DPPH) en

Capítulo 3

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3.2.4.3.3Análisis de Regresión Múltiple paso a paso (ARM stepwise)

Es una técnica que permite hacer un estudio cuantitativo de los datos por medio de un modelo de regresión lineal, permitiendo estudiar (explicar o predecir) la relación funcional entre una variable respuesta Y (variable dependiente) y dos o más variables regresoras X (variables independientes o predictoras). Mediante la regresión se estudia cómo los cambios en las variables predictoras afectan a la variable respuesta, por medio del ajuste de un modelo para la relación funcional entre ambas. Genéricamente, esta relación se modela de la forma: Y=β0 + β1 X1 +β2 X2 +…. Βn. Los coeficientes β0,β1,β2,…. βn permiten estudiar la relación entre

los dos tipos de variables, ya que el signo y la magnitud de cada uno determina la dirección y la intensidad o importancia, respectivamente, relativa de cada variable independiente sobre la variable dependiente. El ARM en el modo paso a paso (stepwise) selecciona las variables regresoras a incluir o eliminar del modelo de regresión de acuerdo a los valores respectivos del estadístico F. El valor F de cada variable regresora indica su significancia estadística en la explicación de la variable respuesta. En esta tesis, se seleccionaron las variables cuyos valores de F fueron mayores a 3.

El ARM además de brindar evidencia adicional sobre la relación entre el perfil fenólico y la CA medida por FRAP, ABTS y DPPH, se aplicó para estudiar mediante el análisis de los coeficientes de regresión Beta (β) la importancia de las variables predictoras, es decir aquellos compuestos polifenólicos que explicarían de mejor manera la CA observada en las muestras.

Capítulo 3

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3.3 Descripción de los resultados y discusión

Teniendo en cuenta los diferentes mecanismos de acción por los cuales los polifenoles podrían estar ejerciendo su acción, la capacidad antioxidante (CA) de las muestras se midió

por diferentes métodos (Moon & Shibamoto, 2009). En este sentido, la CA in vitro se midió

mediante los ensayos FRAP, que mide el poder reductor, y ABTS y DPPH, donde ambos miden la capacidad de captación de radicales libres. A continuación se muestran los

resultados obtenidos de la capacidad antioxidante (CA) in vitro a lo largo de la vinificación de

V. vinifera L. cv. Syrah, Merlot y Cabernet Sauvignon. Los vinos y las fermentaciones se analizaron sin tratamiento previo, mientras que para uvas y orujos, la CA se determinó sobre sus extractos polifenólicos.