Estudios proteómicos por 2D-PAGE y MALDI-TOF/TOF

La proteómica es el campo de análisis del proteoma celular o conjunto de proteínas

expresadas por un genoma en un determinado momento (Khan et al., 2011); su objetivo

principal es la identificación y caracterización de las proteínas que intervienen en la regulación del metabolismo celular. Entre las tecnologías que se utilizan para el análisis del proteoma celular, la electroforesis bidimensional permite separar las proteínas en un primer momento de

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acuerdo a su punto isoeléctrico y luego según su peso molecular (Anderson et al., 2000). Las

proteínas separadas, son luego identificadas por espectrometría de masa y posterior estudio bioinformático de los resultados obtenidos.

Procedimiento. Los estudios proteómicos se llevaron a cabo con el vino de Vitis

vinifera L. cv. Syrah. Se evaluaron los cambios en el proteoma celular de S. cerevisiae tratada con el vino Syrah, expuesta o no al H2O2.

1° Preparación de la muestra para 2D-PAGE. Las células de los diferentes

tratamientos en estudio se recogieron por centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C y se lavaron cinco veces con buffer 50 mM Tris-HCl pH 8,0 contenido 8 M urea, 1 mM EDTA, 40 mM DTT y 0,1 % v/v Triton X-100. Las células lavadas (0,2 g) se suspendieron en buffer de lisis 50 mM Tris-HCl pH 8,0 contenido 8 M urea, 1 mM EDTA, 40 mM DTT, 0,1 % v/v Triton X-100, 1 mM PMSF, 1X cocktail de inhibidores de proteasas y 2 % p/v PVP, y se lisaron utilizando perlas de vidrio de 1 mm de diámetro (1 g de perlas) en cinco ciclos, alternando 1 min de agitación vigorosa en vortex (Decalab, Argentina) y 1 min de enfriamiento en hielo. El debris celular se eliminó por centrifugación a 14.000 x g durante 15 min a 10 °C, y el sobrenadante obtenido se recuperó, se fraccionó y se almacenó a -80 °C hasta análisis por electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Una alícuota de estos extractos proteicos se utilizó para determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford (1976). El contenido osciló entre 2-3 µg de proteínas por µL de extracto.

2° 2D-PAGE. Las proteínas se separaron en una primera dimensión en función de su

punto isoeléctrico, utilizando tiras comerciales con gradiente inmovilizado de pH (tiras IPG 3- 11 NL de 13 cm) siguiendo la metodología indicada por el proveedor. Brevemente, una alícuota de los extractos proteico se purificó y concentró mediante 2-D Clean-Up kit (kit que permitió el 100 % de recuperación de las proteínas, determinado mediante ensayos previos de control de recuperación). Inmediatamente las proteínas se disolvieron en buffer de rehidratación (7M urea, 2M thiourea, 2% p/v CHAPS, 0,5% v/v buffer IPG 3-11 NL, 0,002% p/v azul de bromofenol). Las muestras en la solución de rehidratación se centrifugaron a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y se cargaron (250 µL de solución conteniendo 100 µg de proteínas) en las tiras IPG 3-11 NL de 13 cm. La tira se rehidrató durante 16 h a temperatura ambiente (rehidratación pasiva). Finalizada la rehidratación, el isoelectroenfoque (IEF) de las proteínas se llevó a cabo en un separador bidimensional de

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proteínas Agilent 3100 OFF-GEL (Agilent Technology) a 20°C, limitando la corriente por tira a 50 µA como máximo y empleando el siguiente programa de voltaje: incremento lineal hasta 500 V en 1 h; incremento lineal hasta 1000 V en 1 h; incremento lineal hasta 8000 V en 2:30 h, hasta llegar a un total de 17 kVh. Luego del IEF, y previo a la segunda dimensión, las tiras se redujeron durante 15 min a temperatura ambiente con 5 mL de buffer de equilibrado (6M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,3 % v/v glicerol, 2 % p/v SDS, 0,002 % p/v azul de bromofenol) suplementado con DTT (10 mg/ mL) y seguidamente se alquilaron durante otros 15 min con 5 mL de buffer de equilibrado suplementado con IAA (25 mg/ mL). Los geles equilibrados inmediatamente se sometieron a una segunda dimensión, en donde las proteínas se separaron de acuerdo a su peso molecular sobre geles de poliacrilamida (12 % p/v de acrilamida y 1,5 mm de espesor) en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), utilizando un equipo Protean II xi Cell (Bio-Rad, USA). La electroforesis se llevó a cabo a 25 mA/ gel durante 15 min y 35 mA/ gel el tiempo restante, hasta que el azul de bromofenol alcanzó la zona final del gel. El buffer de corrida empleado fue 25 mM Tris- 192 mM glicina- 0,1 % v/v SDS y la temperatura durante la corrida se mantuvo a 10 °C. Para la evaluación de los pesos moleculares de las proteínas separadas se utilizó Precision Plus Protein Unstained, una mezcla comercial de proteínas con peso molecular conocido (10 a 250 kDa). Finalizada la corrida electroforética bidimensional, las proteínas se fijaron durante 1 h con una solución conteniendo 40 % v/v de etanol y 10 % de ácido acético. Seguidamente los geles se tiñeron con azul brillante de coomassie coloidal G-250 durante 12 h, y a continuación se decoloraron con agua ultra pura. Tres réplicas experimentales de cada tratamiento fueron obtenidas.

3° Obtención y análisis de las imágenes de los geles. Finalizada la decoloración de los geles, las imágenes de las proteínas separadas se obtuvieron inmediatamente utilizando el equipo EC3 Imaging System (UVP). Las mismas se analizaron utilizando el programa para análisis de geles bidimensionales Melanie (versión 6.0; GENEBIO, USA). El análisis cuantitativo de los geles se llevó a cabo de acuerdo a las indicaciones del programa. Las

proteínas se cuantificaron en base a sus volúmenes normalizados (respecto a todos los spots

de proteínas en el gel). Se evaluó la reproducibilidad entre las réplicas experimentales de un mismo tratamiento obteniéndose r ≥ 0,80. Finalmente, se buscaron las proteínas con expresión diferencial entre tratamientos. En este sentido, las proteínas se consideraron diferencialmente expresadas cuando la diferencia entre las intensidades fue significativamente (p < 0,05) mayor a 2,0.

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4° Análisis MALDI-TOF/TOF e identificación de proteínas. Los spots de proteínas

con expresión diferencial fueron manualmente cortadas y extraídas de los geles para su

análisis por MALDI-TOF/TOF. Se siguió la metodología propuesta por Shevchenko et al.

(2006) para la digestión in gel de las proteínas. Brevemente, previo a la digestión los spots se

lavaron, se redujeron y alquilaron. La digestión proteolítica de cada spot se llevó a cabo por

agregado de 10 µL de una solución de tripsina de concentración 10 ng/ µL en bicarbonato de amonio 50 mM, durante 16 h a 37 °C con agitación suave. La mezcla de péptidos resultante se extrajo con una solución 0,5 % v/v TFA (ácido trifluoracético) en 50 % v/v ACN (acetonitrilo). Los péptidos en solución se concentraron en Speed Vac a 30 °C. Una alícuota de 0,5 µL se dispensó sobre una placa de MALDI (MTP AnchorChip) con 0,5 µL de solución matriz CHCA (α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) (3 mg/ mL de CHCA en solución 0,1 % TFA en 70 % ACN). La mezcla de péptidos se analizó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF Ultraflex II (Bruker Daltonics, USA) operado en modo ion reflector positivo y calibrado con una mezcla estándar de péptidos de Bruker Daltonics (Service Kit 1 #225993). Las proteínas se identificaron por comparación de los espectros de MS y MS/MS

contra bases de datos de proteínas utilizando MASCOT (Matrix Science

http://www.matrixscience.com/search) como programa de búsqueda. La identificación de las proteínas se llevó a cabo con los siguientes parámetros de búsqueda: base de datos: NCBInr; enzima: tripsina; sitios de corte trípticos perdidos: 2; tolerancia de masa monoisotópica: 200 ppm; tolerancia de masa de los fragmentos: 0,8 Da; modificación fija: carbamidometilación; modificación variable: oxidación de metioninas. Los parámetros masa de la proteína y taxonomía no fueron restringidos. Puntajes significativos (p < 0,05) se utilizaron como criterio para identificar correctamente las proteínas. Los análisis fueron realizados en CEQUIBIEM- UBA.