ENSAYOS EN LABORATORIO

Los ensayos de toxicidad realizados con nauplii de Balanus amphitrite en el laboratorio demostraron un marcado efecto inhibitorio del timol con un LC50 de 3,7µM para las 24 horas

de exposición (Figura 81). A su vez, los resultados indican que el efecto inhibidor del timol se incrementa con la concentración. Todos los organismos expuestos a las distintas concentraciones de timol recuperaron su actividad normal cuando fueron transferidos a agua limpia, por lo que se infiere que el efecto inhibidor es temporal. En cuanto al ensayo de asentamiento se comprobó que la concentración inhibitoria para el 50% de la población de cypris es 1,95µM (Figura 82). Figura 81. Bioensayo de toxicidad de 24 horas para B. amphitrite en soluciones de timol. Figura 82. Bioensayo de asentamiento de 24 horas para B. amphitrite en soluciones de timol. concentración timol (M)     po rc en ta je 0 20 40 60 80 100 120 cipris fijadas cipris inactivas cipris nadadoras

120 Respecto de la evaluación de las propiedades antiincrustantes del guayacol se pudo observar que presenta un comportamiento similar al del timol, con un LC50= 0,71mM (Figura 83). Sin

embargo, el efecto observado fue permanente o tóxico dado que en el test de recuperación sólo entre un 40‐60% de las larvas expuestas logra recuperarse aún en las concentraciones más bajas. Por otra parte, el valor hallado para el bioensayo de asentamiento fue EC50=0,61mM (Figura 84). Figura 83. Bioensayo de toxicidad de 24 horas para B. amphitrite en soluciones de guayacol. Figura 84. Bioensayo de asentamiento de 24 horas para B. amphitrite en soluciones de guayacol. concentración guayacol (mM) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 % naup lii inact ivas 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 nauplii inactivas nauplii recuperadas % naupli i recuperad as concentración guayacol (mM) 0 0,091 0,182 0,364 0,91 1,82 po rcen ta je 0 20 40 60 80 100 cipris fijadas cipris inactivas cipris nadadoras

121 El comportamiento del eugenol fue también satisfactorio, el test de toxicidad para 24 horas indica un valor de LC50= 0,094µM (Figura 85). En este caso, el test de recuperación demuestra

que este compuesto presenta un efecto inhibidor temporario sobre las larvas, similar al observado en los ensayos con timol. En el test de asentamiento se obtuvo un valor de EC50= 0,023µM (Figura 86). Figura 85. Bioensayo de toxicidad de 24 horas para B. amphitrite en soluciones de eugenol. Figura 86. Bioensayo de asentamiento de 24 horas para B. amphitrite en soluciones de eugenol.

El índice terapéutico (IT) LC50/EC50 (Rittschof et al., 1991) para los compuestos estudiados es:

• IT timol= 1,9 • IT guayacol= 1,1 • IT eugenol= 4,09 concentración eugenol (M) 0 0,015 0,03 0,06 0,15 0,3 1,15 naupl ii ina c tivas (% ) 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 nauplii inactivas nauplii recuperadas na uplii r e cupera das ( % ) concentración eugenol (µM) 0 0,015 0,03 0,06 0,15 0,3 1,5 por c e nt a je 0 20 40 60 80 100 120 cipris fijadas cipris inactivas cipris nadadoras

122 Estos valores indican que los compuestos actúan por un mecanismo de acción no tóxico, como puede corroborarse con las pruebas de recuperación de los ensayos con timol y eugenol. Sin embargo, en el caso del guayacol el bajo porcentaje de recuperación y el valor de IT próximo a 1, estarían indicando un cierto grado de toxicidad. ENSAYOS EN EL MAR Los resultados obtenidos luego de la inmersión en el mar durante 6 meses en Mar del Plata demuestran que las pinturas formuladas a base de timol y de guayacol presentaron muy buenos resultados dado que disminuyeron la densidad y diversidad específica del micro y del macrofouling (Figura 87 y Figura 88). Figura 87. Panel pintado con pintura AF con timol y control, 6 meses de inmersión. Figura 88. Bastidor con paneles pintados con pintura AF con guayacol y controles, 6 meses de inmersión. Se observaron diferencias significativas con respecto a los controles en la fijación de ciertas diatomeas como Achnanthes sp., Nitzschia longissima, Melosira sp., Lycmophora sp. y algunos macroorganismos como Enteromorpha intestinalis, Ectocarpus sp., Bugula spp., Ciona

intestinalis y Botryllus spp. (p<0.05). Es importante destacar la ausencia de organismos con

123 eugenol como pigmento antiincrustante no pudieron ser evaluadas dado que los bastidores se perdieron durante una tormenta.

Los resultados obtenidos luego de la inmersión en el mar durante 28 días en Santa Marta demuestran que las pinturas formuladas a base de guayacol y avarol presentaron muy buenos resultados dado que disminuyeron la densidad y diversidad específica del micro y del

macrofouling (Figura 89). Aunque no hay diferencias significativas en los tratamientos, debido

al bajo porcentaje de cobertura por el poco tiempo de inmersión se observa una reducción de la fijación del alga parda en los tratamientos con guayacol y avarol. El porcentaje de poliquetos fue menor que en el CN en los tratamientos con timol y guayacol y el porcentaje de hidrozoos se redujo en los tratamientos con isogenol, eugenol, guayacol y avarol (Figura 90). Figura 89. Cobertura de organismos en placas con Phytagel®. La barra indica el error estándar. Figura 90. Cobertura de organismos en placas con Phytagel® y los compuestos sinteticos. Control (A); guayacol (B) y timol (C). 0 5 10 15 20 Control positivo Control negativo

Timol Isogenol Eugenol Guayacol Avarol

Porcentaje

 de

 cobertura

Tratamiento

Alga parda Alga roja Hidrozoos Briozoos

Poliquetos Cirripedios Ascidias 10

0

124

1.4

CONCLUSIONES

Para obtener los extractos y fracciones se requieren volúmenes de muestra relativamente grandes, ya que tienen porcentajes de humedad muy altos, superiores al 85% para el caso de las ascidias; entre el 73‐79% para las esponjas Agelas tubulata, Oceanapia peltata y

Cinachyrella kuekenthali y aproximadamente 56% para Spirastrella coccinea. También hay

que considerar las pérdidas durante el proceso de limpieza que puede estar entre el 10 y 70% del peso colectado y el porcentaje de rendimiento que es variable tanto por especie como por época del año en que se realice la colecta.

En el ensayo de inclusión de los extractos y fracciones en el Phytagel® los mejores resultados

antifouling, incluso frente al control positivo se observaron en el ED y la FA de Neopetrosia proxima, el EN y el ED de Aplysina lacunosa y Holothuria glaberrima, el ED de Myrmekioderma gyroderma y el ED y la FO de O. peltata. Los tratamientos que cuya actividad antifouling fue

superior al del control negativo en un 50% fueron EN y ED de A. tubulata, FA y FO de A.

lacunosa y de H. glaberrima, ED de S. coccinea y EN, ED y FA de Phallusia nigra. El EN, el ED, la

FA y la FO de C. kuekenthali y Biemna cribaria presentaron efecto antifouling comparado con el control negativo pero la diferencia fue menor al 50%.

Aunque no fue posible establecer claramente la tasa de liberación de los extractos si fue evidente en las pruebas de cromatografía de capa delgada que no existe degradación apreciable de los compuestos presentes en las mezclas de metabolitos luego de ser incluidos en el gel inerte y colocados en el mar durante 28 días.

El asentamiento de cypris de Balanus amphitrite a las 72 horas demostró que N. proxima presentó un menor porcentaje de fijación y de metamorfosis en todos los tratamientos que el control negativo; el EN a la mayor concentración y la FO a ambas concentraciones (20 y 200µg.cm2_{) fueron los que mejor inhibieron la fijación y metamorfosis de las cypris}

presentando diferencias significativas; la mortalidad fue similar en todos los tratamientos. Las FO en ambas concentraciones de O. peltata presentaron un mejor comportamiento que el control negativo, especialmente la FA‐200, no se presentaron diferencias estadísticas en la fijación, pero si en la metamorfosis, la mortalidad fue homogénea en los tratamientos. A.

lacunosa fue la especie que presentó menor actividad inhibitoria del asentamiento; todos los tratamientos fueron muy similares e incluso la FA‐200 fue superior al control negativo; no se presentaron diferencias significativas ni en la fijación ni en la metamorfosis. En el ensayo con H. glaberrima los tratamientos fueron mejores que el control negativo, aunque sin diferencias significativas, siendo el mejor tratamiento el de la FO‐200.

Los extractos de los organismos ensayados presentaron diferentes rangos de toxicidad. A.

tubulata, A. lacunosa y O. peltata arrojaron que la LC50 está por encima de 100mg.L‐1, para H.

glaberrima fue de 74,2mg.L‐1 _{para el EN y 65,3mg.L}‐1 _{para la FA; mientas que la de M.}

gyroderma en el EN es de 7,1mg.L‐1 _{y en la FA es de 46,8mg.L}‐1_{. Por último la que reportó}

mayor nivel de toxicidad, fue N. proxima con LC50 de 74,2mg.L‐1 en el EN y 9,1mg.L‐1 en la FA.

125 Las pinturas que presentaron mejor comportamiento tanto en Mar del Plata (Argentina) como en Santa Marta (Colombia) fueron las que contenían fracciones orgánicas de Agelas tubulata, Holoturia glaberrima y Neopetrosia proxima. Además, en Santa Marta la pintura con fracción orgánica de Apyisina lacunosa tuvo buen comportamiento.

Las diferencias en cuanto a la efectividad de las pinturas entre los puertos puede estar asociada a la diversidad y abundancia de organismos en cada lugar, aunque es interesante ver que los resultados, guardadas las proporciones, los arrojen las mismas especies.

Los compuestos sintéticos evaluados actúan por un mecanismo de acción no tóxico, como puede corroborarse con las pruebas de recuperación de los ensayos con timol y eugenol, aunque en el caso del guayacol se evidencia cierto grado de toxicidad.

Las pinturas formuladas a base de timol y de guayacol presentaron muy buenos resultados dado que disminuyeron la densidad y diversidad específica del micro y del macrofouling, inhibiendo la presencia de organismos con exoesqueleto calcáreo sobre los paneles pintados.

El potencial de los organismos marinos para la producción de sustancias antifouling es muy grande, dado que de 10 especies evaluadas, las seis que se seleccionaron en función de los resultados de los ensayos previos, dieron buenos resultados al incorporar las FO a las pinturas y cinco de ellas con diferencias significativas frente al CN. De las cuatro especies cuyas FO no fueron incluidas en las pinturas al menos tres dieron resultados que indican que pueden tener actividad antifouling interesante. La mayor dificultad es la obtención de suficiente extracto y /o fracción para poder desarrollar las pruebas especialmente las de campo (Phytagel® y pinturas) que requieren mayores cantidades de muestra, pero que dan un mejor acercamiento al potencial antifouling de los organismos evaluados.

126

1.5

CONSIDERACIONES FINALES

Debido a los excelentes resultados obtenidos en esta serie de experiencias sería de sumo interés continuar con este tipo de estudios, realizando ensayos sumergiendo paneles pintados por períodos más prolongados a fin de verificar el efecto de los extractos sobre otras especies presentes en distintas épocas del año. También se deben estudiar en laboratorio y en el mar combinaciones de extractos para detectar efectos sinérgicos con el fin de potenciar la actividad antifouling.

También es trascendental realizar ensayos bioguiados para establecer que molécula o moléculas de la FO son las responsables de esta actividad y así ofrecer una alternativa más real para su uso, ya sea obteniendo el producto por síntesis química o mediante cultivos de organismos o de tejidos.

La interacción entre los grupos de investigación del CIDEPINT y el INVEMAR fue de gran importancia para avanzar en el desarrollo de nuevas investigaciones en este campo, tanto por el intercambio de conocimientos y experiencias como de tecnologías y experticias propias de cada uno. Se debe mejorar la resolución en la identificación de los organismos del fouling en el Caribe colombiano, dado que conociendo mejor la diversidad, se pueden ampliar la aplicación de los resultados estableciendo si las sustancias presentan actividad específica frente a alguna especie en particular y si es posible utilizar mezclas de compuestos que potencialicen los efectos para reducir las incrustaciones biológicas en las estructuras sumergidas.

El interés por el trabajo en este tema en Colombia no es muy amplio y es difícil establecer asociaciones con otros grupos que desarrollan líneas similares. El grupo de corrosión y de la Universidad de Antioquia manifestó su interés en vincularse a nuevas investigaciones en el tema por lo que se seguirá trabajando para fortalecer este tipo de alianzas.

127

1.6

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