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Anexos
1 Anexo informe técnico
1.1
Introducción
El espacio libre es un recurso limitante muy importante en las comunidades marinas de sustrato duro. En muchos lugares, cualquier sustrato que no es efímero, regularmente perturbado o defendido, será colonizado por organismos con limitaciones de espacio (Henrikson y Pawlik, 1998). La epibiosis, fenómeno muy frecuente en el medio acuático (Wahl, 1989); es una asociación facultativa entre organismos vivos, de donde resulta una amplia variedad de interacciones ecológicas, no sólo entre los integrantes de la asociación, sino también entre estos y otras especies de una comunidad. La epibiosis puede ser favorable, neutra o tener efectos letales, por lo tanto, juega un papel importante en la ecología de organismos sésiles, lo que puede tener un impacto importante sobre el establecimiento, dinámica y estructura de una comunidad (Henrikson y Pawlik, 1998; Enderlein, 1999).
La humanidad empezó a enfrentarse con este fenómeno desde tiempos milenarios, cuando inició la navegación marítima y las estructuras eran colonizadas por macroorganismos marinos. Actualmente este proceso natural se denomina biofouling y es la fijación y crecimiento de micro y/o macroorganismos sobre cualquier sustrato sumergido natural o artificial, lo cual afecta seriamente la infraestructura costera y las estructuras sumergidas (p. ej., muelles, cascos de barcos, filtros, desagües, plataformas, sistemas de cultivo, etc.) causando corrosión, deterioro y obstrucción, ocasionando graves pérdidas económicas; incrementando el consumo de combustible hasta en un 40% debido al incremento de la resistencia a la fricción, aumento de peso, pérdida de velocidad y maniobrabilidad (IMO‐International Maritime Organization, 2002; Yebra et al., 2004; Chambers et al., 2006); además favorece la introducción de especies invasoras poniendo en riesgo los ecosistemas locales (Nehring, 2001; Callow et al., 2003; Minchin y Gollasch, 2003; Maréchal et al., 2004; Yebra et al., 2004; Löschau y Krätke, 2005). Este fenómeno es descrito como un proceso que implica una serie de etapas para la consolidación de una comunidad de organismos incrustantes, que está sujeta a variación en función de las condiciones reinantes en el sistema. Una de las aproximaciones ampliamente aceptada considera un proceso de cuatro fases: el acondicionamiento bioquímico, el asentamiento y crecimiento primero de bacterias pioneras, posteriormente el de los organismos unicelulares y procariotas de estados tardíos (microepibiontes) y el desarrollo de macroepibiontes (eucariontes multicelulares) (Wahl, 1989; Railkin, 2003; Chambers et al., 2006).
La primera etapa constituye el acondicionamiento bioquímico del sustrato, a través de la adsorción de material orgánico disuelto como polisacáridos, proteínas, lípidos, ácidos húmicos, ácidos nucléicos y aminoácidos en la superficie, inmediatamente después de que el sustrato entra en contacto con el agua de mar. Este fenómeno da lugar a la formación de la película condicionante, una fuente concentrada rica en carbón que posibilita la segunda etapa, que corresponde al asentamiento y crecimiento de procariotas pioneras (Yebra et al., 2004). Estas se
21 convierten en los primeros organismos en adherirse a la superficie, aunque inicialmente de forma no permanente o reversible (Harder y Yee, 2009). Sin embargo, esta condición es superada en cuanto alcanzan un contacto más íntimo con el sustrato (adhesión irreversible), desarrollando microcolonias que interactúan de forma compleja, cambiando incluso sus caracteres fenotípicos para conformar una matriz colectiva de material extracelular denominada biopelícula (Stoodley
et al., 2002). La tercera etapa la constituye la adhesión de otros grupos de organismos
unicelulares a la biopelícula; en esta, se incorporan microalgas, hongos, protozoarios y bacterias de estados tardíos, denominados microepibiontes (Wahl, 1989; Mitbavkar y Anil, 2008), que responden al reacondicionamiento otorgado a la superficie, por la formación de la biopelícula bacteriana, la cual incide sobre las propiedades fisicoquímicas del sustrato, pudiendo bien inhibir o promover el desarrollo de otros organismos (Callow y Callow, 2006). Finalmente, durante la cuarta y última etapa, para la consolidación de la comunidad, se incorporan los invertebrados marinos de mayor tamaño, junto con las macroalgas, denominados macroepibiontes (Figura 1) (Yebra et al., 2004).
Figura 1. Estructura temporal del asentamiento (modificado de Yebra et al., 2004).
Para afrontar este problema surgen inicialmente mezclas de brea y posiblemente cobre como revestimiento para proteger las embarcaciones de madera de los organismos colonizadores (Almeida et al., 2007; Dafforn et al., 2011), luego se utilizaron mezclas con revestimientos metálicos de plomo, azufre y arsénico (Yebra et al., 2004); nuevas combinaciones de sustancias para crear recubrimientos metálicos con cobre; revestimientos de madera con reforzantes como alquitrán, junto con productos de origen animal y clavos de cobre (Almeida et al., 2007). También se experimentó con otros metales como níquel, plomo, zinc, acero galvanizado entre otros, que culminaron por descartar el cobre temporalmente como revestimiento, debido a que su interacción con el hierro generaba corrosión en las embarcaciones, hasta el desarrollo de aleaciones de zinc‐cobre que dieron una relativa solución al problema. Se probaron revestimientos no metálicos; no obstante, su alto costo y difícil aplicación los convertían en alternativas poco rentables. A mediados del siglo XIX, aparecieron las primeras pinturas basadas
Macrofouling
Microfouling Colonizadores terciarios
Colonizadores secundarios Colonizadores primarios Film orgánico Sustrato ####################################################################################################################################
1 min. 1-24 h 1 semana 2-3 semanas
Adhesión departículas orgánicas (ej. proteínas)
Bacterias (Pseudomonas, Vibrio ) Diatomeas (Achnantes, Melosira ) Esporas de macroalgas (Enteromorpha ) Protozoos (Zoothamnium, Vorticella ) Larvas de macrofoulers (Balanus, Hydroides, Ciona )
22 en óxidos de cobre, mercurio o arsénico como sustancias tóxicas dispersables (Almeida et al., 2007).
Estas primeras pinturas antifouling se basan en la dispersión de un poderoso tóxico en un aglutinante polimérico (Almeida et al., 2007). Luego aparecen las pinturas hot‐plastic paint a base de aglutinantes naturales con cobre u otros tóxicos, las cuales eran poco efectivas, de corta duración, bastante costosas y de difícil aplicación. Con el desarrollo de la química polimérica aparecen las cold‐plastic paint, que utilizan resinas sintéticas, productos naturales solos o combinados con ellas, las cuales mejoraron la efectividad en el control del fouling y los períodos entre intervenciones en dique seco (re‐pintado) (Yebra et al., 2004). Luego de sucesivos desarrollos aparecen las pinturas organometálicas a base de estaño, arsénico, mercurio y pesticidas como el DDT (Evans et al., 2000; IMO, 2002), que dan lugar a las pinturas basadas en tributilestaño (TBT), que se convirtieron en un éxito comercial por su eficiencia, versatilidad y bajo costo (IMO, 2002; Almeida et al., 2007).
Las pinturas son “materiales compuestos” que desde el punto de vista físico‐químico pueden ser considerados como sistemas heterogéneos constituidos por una o más fases sólidas finamente divididas (pigmentos), dispersas en un medio fluido denominado vehículo (ligante y solventes) y por otros constituyentes que, agregados en bajas proporciones, aportan alguna función a la pintura en estado líquido o como película seca (aditivos). Cuando este material se aplica en forma de capas delgadas se obtiene una película sólida, ya sea por secado o curado (Rascio et al., 1977). Los ligantes son los responsables de la formación de la película, los solventes aportan la fluidez necesaria para que la pintura pueda ser aplicada y regulan la velocidad de secado; por otra parte, los pigmentos le dan a las pinturas propiedades específicas tales como dureza, adhesión, opacidad, resistencia a las radiaciones, a agentes químicos, a la corrosión, al asentamiento de organismos, entre otras. En tecnología de pinturas existen numerosos ligantes cuya elección adecuada dependerá del rol a cumplir. Se clasifican en tres grandes grupos: ligantes y resinas naturales, resinas sintéticas base solvente y resinas sintéticas base acuosa (Rascio et al., 1977).
En general, las formulaciones de pinturas emplean mezclas o sistemas de solventes que están diseñados para facilitar la fabricación y aplicación de las pinturas, mejorar las propiedades de flujo y nivelado de la película formada, disminuir la concentración de compuestos orgánicos volátiles (VOC) y el costo total de la pintura. Estos sistemas contienen un “disolvente” de la resina y también “diluyentes” que, además de diluir el producto, permiten reducir los costos de fabricación y facilitar la aplicación. La elección de la mezcla solvente es importante ya que debe mantener la resina solubilizada hasta que se haya evaporado toda la mezcla. La composición del sistema de solventes varía durante la evaporación; los solventes con mayor presión de vapor evaporan más rápido que los de menor presión de vapor, quedando estos últimos retenidos en la película por más tiempo. Así, en el diseño del sistema de solventes debe tenerse en cuenta que el solvente con menor presión de vapor sea el que disuelve la resina dado que, si esto no ocurre, la resina precipitaría y la película resultaría débil y porosa (Hare, 1991a). Además, la selección de los solventes adecuados es de gran importancia para la formación de la película seca; si los solventes evaporan excesivamente rápido, la película aparecerá con defectos en su superficie
23 tales como cráteres o burbujas, o bien puede resultar un mojado inadecuado del sustrato causando problemas en la adhesión de la pintura. En cambio, si los solventes evaporan lentamente, la pintura puede “chorrear” y aparecerá un “efecto cortina” en la película seca que puede afectar el curado. Entre los solventes más empleados en la formulación de pinturas se encuentran los compuestos orgánicos volátiles (VOC) que incluyen hidrocarburos alifáticos, aromáticos, alcoholes, cetonas, ésteres, éteres glicoles, etc. El alifático más utilizado es el aguarrás mineral, mezcla de destilados del petróleo usado fundamentalmente con resinas alquídicas; los aromáticos más utilizados son el xileno y tolueno, productos con bajo costo y aptos para su empleo como disolventes y/o diluyentes (Hare, 1991b). Otros solventes empleados en la formulación de pinturas son las cetonas (Chatfield, 1962; Ellis, 1986), los ésteres (Hare, 1991c), los alcoholes y los éteres glicoles (Ellis, 1986). Debido a su toxicidad y a las restricciones impuestas a su uso, están siendo remplazados por agua (Hare, 1991d; Stout, 1998). El empleo de agua como solvente requiere el diseño de nuevos polímeros y demanda innovación ya que solubiliza pocas resinas por sus características polares. A pesar de esto, ya existen resinas que pueden ser utilizadas en pinturas acuosas y tienen buena aceptación y rendimiento.
Los pigmentos son sustancias sólidas finamente divididas, minerales u orgánicas, generalmente insolubles en los constituyentes de una pintura a la que le otorgan diferentes propiedades; se mantienen dispersos en forma estable y proporcionan a la película un color característico, tienen poder cubritivo y resistencia a la intemperie. En una pintura antiincrustante existen básicamente tres tipos de pigmentos: opacantes, extendedores y antiincrustantes (Hare, 1990a). Los pigmentos opacantes tienen un índice de refracción mayor que el de las resinas utilizadas por lo cual la luz que penetra en la película pigmentada es refractada varias veces antes de llegar al sustrato. El efecto final es que el sustrato no resulta visible (Balfour, 1992). Los pigmentos extendedores son utilizados para proporcionar a la película ciertas características tales como dureza, adhesión y durabilidad. También juegan un papel importante en la estabilización del brillo, en las propiedades reológicas, en ciertas propiedades mecánicas, aplicación y procesos de nivelado y flujo, a su vez, pueden actuar como pigmentos auxiliares en la optimización de las propiedades funcionales de la pintura. Según su naturaleza química se los clasifica en carbonatos, sulfatos y silicatos. Los más utilizados en pinturas son tiza (carbonato de calcio), barita (sulfato de bario), talco y mica (Hare, 1990b).
Los aditivos son generalmente definidos como aquellos componentes que, incorporados a la formulación de la pintura en pequeñas cantidades (entre 0,05 y 2%), sirven para controlar las propiedades de la pintura tanto en estado líquido como una vez que ha curado. La función de cada aditivo es específica, entre ellos se encuentran emulsificadores, agentes humectantes, agentes reológicos, promotores de adhesión, absorbedores UV, secantes, antiespumantes, plastificantes, dispersantes, surfactantes, inhibidores de flash rusting, entre otros (Cowley y Gallon, 1988; Athey y Porowska, 1995; Reinhardt et al., 1998; Verkholantsev, 1999).
24 Las pinturas antiincrustantes o antifouling son películas que producen una liberación controlada del o los pigmentos que contienen generando una interface altamente tóxica que evita la fijación de organismos (Caprari y Lecot, 2001). Una pintura antiincrustante posee características muy particulares que, por su modo de acción, se diferencia totalmente de los demás tipos conocidos; la película de pintura modifica permanentemente sus características cuando está sumergida. En la formulación de las pinturas antiincrustantes se emplean sustancias tóxicas que deben ser liberadas desde el film con la finalidad de proteger la parte sumergida de las embarcaciones. El objetivo fundamental es lograr la adecuada solubilización de tóxico. La pérdida de tóxico tiene un valor mínimo crítico que depende del tóxico usado y de la formulación de la pintura, por debajo de ese valor, la pintura no tiene acción preventiva. La solubilización inicial del biocida (leaching rate inicial) es generalmente elevada ya que resulta del exceso de tóxico acumulado en la película de pintura. Este valor es importante ya que la pintura debe comenzar a actuar inmediatamente después de la inmersión y la efectividad dependerá de la solubilidad del tóxico, de las características del vehículo, del área superficial de partículas de tóxico y de las condiciones de temperatura, salinidad y pH del agua. Después de varios días de inmersión se alcanza un valor de lixiviación constante (leaching rate constante). Si la pintura funciona correctamente, el tóxico expuesto en la superficie se disolverá dentro de los valores previstos, pero puede ocurrir que la acción de la pintura se anule rápidamente, no por excesiva solubilización de tóxico o agotamiento, sino porque quede bloqueado en el interior del film.
Las pinturas deben ser aplicables con facilidad en grandes superficies, secar rápidamente y proporcionar un film bien adherido y libre de irregularidades. Se debe preparar el sustrato a proteger con una imprimación con buena adhesión y con rugosidad adecuada.
Las pinturas antiincrustantes pueden clasificarse en tres tipos, las de matriz soluble, las de matriz insoluble y las autopulimentables. En las pinturas de matriz soluble, el tóxico y el vehículo se solubilizan conjuntamente, con disminución del espesor del film (Figura 2). Para la formulación del vehículo se emplea la resina colofonia, de naturaleza ácida, que es el principal material formador de película. La resina colofonia es de origen natural, se extrae de coníferas y es soluble o erosionable por el agua, es de naturaleza ácida y está compuesta por un 90% de ácidos resínicos, principalmente ácido abiético y levopimárico (Rascio et al., 1988). Los grupos carboxílicos libres (‐COOH) permiten que reaccione con el agua de mar alcalina (pH 8) formando resinatos solubles y facilitando la liberación del tóxico. Sin embargo, la colofonia genera un film excesivamente soluble, poco adherente y quebradizo, por lo que se la plastifica incorporando aceites o barnices a la formulación; su solubilidad en agua de mar es afectada por el tiempo de secado (Rascio et al., 1977).
25 Figura 2. Esquema del mecanismo de acción de una pintura de matriz soluble a lo largo del tiempo.
Las pinturas de matriz insoluble son conocidas como pinturas de lixiviación por contacto continuo o sistemas de larga vida útil (Figura 3). El componente resinoso es insoluble y no es erosionado por el agua. Hay una gran variedad de polímeros que pueden ser efectivos, como las resinas vinílicas (copolímeros de cloruro‐acetato de polivinilo), acrílicas, caucho‐acrílico, caucho clorado y epoxídicas. También se incluye a la resina colofonia como componente del ligante. El mecanismo de acción es por difusión del tóxico que se encuentra en cantidad elevada para asegurar el contacto continuo entre las partículas, es decir cuando las partículas más superficiales se disuelven y difunden en el agua, quedan expuestas otras partículas disponibles para la disolución posterior. Se diferencian de las pinturas de matriz soluble en que la lixiviación del pigmento forma “galerías” que aumentan la permeabilidad de la película y la salida del biocida de las capas más internas, sin producir disminución del espesor de película del sistema. El vehículo en general es un material suficientemente resistente como para mantener la integridad del film. Figura 3. Esquema del mecanismo de acción de una pintura de matriz insoluble a lo largo del tiempo. e s peso r de p e lí cu la tiempo e s peso r de p e lí cu la tiempo espe s o r de pe lí cu la tiempo espe s o r de pe lí cu la tiempo espe s o r de pe lí cu la tiempo
26 La desventaja de este tipo de formulaciones es que, a medida que el contenido de tóxico se va lixiviando, el esqueleto de la matriz agotada se mantiene, lo que modifica la textura superficial del film aumentando la rugosidad y favoreciendo de este modo la adhesión de esporas o larvas. Por otra parte, las partículas de biocida deben atravesar un espesor mayor de película agotada por lo que la eficiencia de la pintura puede disminuir.
Las pinturas autopulimentables (SPC: self‐polishing copolymer) están formuladas con un polímero acrílico, usualmente metil metacrilato, que se combina con el biocida (TBT) por una unión éster. Estas pinturas liberan el tóxico a partir de una reacción de hidrólisis que se lleva a cabo lentamente permitiendo la salida del tóxico y extendiendo así la zona de reacción (Anderson et al., 2003) (Figura 4).
Entre los pigmentos antiincrustantes más utilizados se encuentra el óxido cuproso, es uno de los compuestos más efectivos incorporados como biocida en pinturas antiincrustantes, actúa a muy bajas concentraciones sobre una amplia variedad de organismos marinos dependiendo de la solubilidad del ligante (Yebra et al., 2004). El cobre es un elemento esencial para el normal crecimiento de organismos, aunque altas concentraciones pueden ser letales (Voulvoulis et al., 1999). Por otra parte, se ha determinado que no posee efecto antiincrustante sobre el alga verde Enteromorpha, abundante en las costas argentinas (Voulvoulis et al., 1999). El cobre posee muy baja solubilidad en agua dulce y aumenta, aunque no de manera sustancial, en agua de mar. El efecto tóxico del cobre aumenta en presencia de óxido de zinc. Sin embargo el óxido de zinc per se no logra inhibir el asentamiento de organismos cuando se lo incluye en una pintura.
27 En las últimas cuatro décadas se han utilizado pigmentos antifouling de excelente poder biocida pero altamente contaminantes y nocivos para la biota. Entre ellos se encuentran el óxido de mercurio (HgO), el arseniato mercurioso (AsO4Hg3), el trióxido de arsénico (As2O3), el arsenito
cuproso (AsO3Cu3) y los organometálicos, principalmente el óxido de tributilestaño (TBTO) y el
óxido de trifenil estaño (TPTF). Sin embargo, no pasó mucho tiempo desde su adopción para que estudios reportaran los impactos que tenían los compuestos organoestánnicos añadidos a las pinturas sobre la vida marina, entre ellos la deformación en las conchas de ostras, cambios de sexo (imposex) (Bettin et al., 1996; Pereira et al., 1999; Wu et al., 2010), respuestas inmunes, afecciones neurotóxicas y genéticas en otras especies marinas (IMO, 2002; Ferraro et al., 2004), bioacumulación del compuesto en mamíferos y debilitamiento inmunológico en peces (Yebra et al., 2004), lo que dio lugar a la imposición de regulaciones estrictas para el uso de esta sustancia en muchos países a partir de 1991, resultando posteriormente en legislaciones que culminaron con la prohibición total de la aplicación de pinturas antifouling basadas en TBT desde el inicio de 2003 y a partir del 2008 la prohibición de la fabricación de pinturas basadas en este compuesto (Chambers et al., 2006). Dado que las pinturas antiincrustantes ha sido el método más ampliamente utilizado, para el control del biofouling y que la mayoría de los tóxicos que se incorporan a las formulaciones, son contaminantes del agua, los sedimentos y pueden bioacumularse en la cadena trófica, es de vital importancia encontrar un método efectivo para su control, ya que es un problema mundial que demanda billones de dólares al año en todo el mundo (Callow et al., 2003).
En virtud de las restricciones impuestas al uso del TBT en formulaciones antifouling han sido desarrollados posibles reemplazantes tales como Irgarol 1051®, Sea‐Nine 211®, chlorothalonil, dichlofluanid, tolylfluanid y zinc pyrithiona (Voulvoulis et al., 1999; Konstantinou y Albanis, 2004; Bellas, 2005). Sin embargo, estos compuestos han sido encontrados en concentraciones relativamente altas en puertos, marinas y zonas costeras (Martínez et al., 2001; Voulvoulis et al., 2000; Voulvoulis et al., 2002; Reitsema, 2008).
Si bien es preponderante encontrar un sistema efectivo en la prevención del biofouling, se deben tener en cuenta ciertos factores que garanticen que una sustancia nociva no será remplazada con otra; por lo tanto, un buen mecanismo antiincrustante debe contar con características tales como: Amplio espectro de actividad. Baja toxicidad. Baja hidrosolubilidad. No acumularse en la cadena alimentaria. No persistir en el ambiente. Ser compatible con materia prima de pinturas. Precio/aplicación favorable. Teniendo en cuenta lo anterior y debido al gran potencial bioactivo encontrado en los productos naturales, particularmente de organismos marinos, se han empezado a hacer ensayos para evaluar la posibilidad de emplearlos, o los compuestos que sintetizan, en la elaboración de
28 pinturas antiincrustantes. Los productos naturales son entidades químicas sintetizadas por células de plantas, animales y microorganismos que no son usados en el metabolismo primario, lo que les ha conferido el nombre de “metabolitos secundarios” (Pawlik, 2011). Las funciones de estos metabolitos no son tan evidentes en la supervivencia de los organismos como lo son los productos del metabolismo primario, sin embargo poseen un rol ecológico fundamental en el desarrollo y supervivencia de las especies que los sintetizan (Harper et al, 2001).
Entre los roles ecológicos que desempeñan los productos naturales se encuentra una serie de interacciones inter e intraespecíficas como la defensa contra la depredación, competencia por espacio, mutualismo, y los procesos reproductivos (Stachowicz, 2001). Un buen ejemplo en el contexto de esta investigación es el del Pineno, un monoterpeno que se encuentra presente en la resina producida por algunas especies de coníferas y es secretada para hacer frente al ataque de insectos que retrasan su desarrollo, estas resinas ya eran usadas a mediados del siglo XIX como aglutinantes en una mezcla de sustancias que se aplicaba a los cascos de embarcaciones para disuadir el asentamiento de fouling, antes de que se conocieran sus propiedades como agente insecticida (Bohlmann et al., 1997; Almeida et al., 2007). Casos como este han sido recurrentes a lo largo de la historia de la civilización humana, dado que los productos naturales consisten en una fuente sin igual de sustancias con una diversidad estructural enorme y que en líneas generales no presenta una gran complejidad estructural (Sticher, 2008).
Los productos naturales marinos empiezan a tener mayor relevancia apenas recientemente, debido al limitado acceso del hombre a estos recursos durante virtualmente toda la historia registrada (Fusetani, 2010). En la actualidad uno de los campos de búsqueda de productos naturales más promisorios el de los organismos marinos, ya que sintetizan metabolitos secundarios que han demostrado tener un gran potencial en campos de investigación de la industria farmacéutica, cosmética y agroquímica. También se ha demostrado su potencial para el desarrollo de sondas moleculares, tecnología enzimática y sus usos se encuentran extendidos hasta la producción de precursores químicos y suplementos nutricionales (Pomponi, 1999). El creciente interés en las sustancias producidas por los organismos marinos se debe principalmente a que muchos de los compuestos que estos producen son únicos a nivel estructural y a que muchos de estos poseen propiedades farmacológicas (Jha y Zi‐rong, 2004). Esta búsqueda de nuevos productos naturales ha resultado en el reporte de más de 18.000 compuestos aislados de 4.796 especies de 24 fila diferentes que equivalen al 0,27% de las especies conocidas de organismos marinos (Blunt et al., 2008). Una de las vertientes más recientes e interesantes en el desarrollo del campo de la química de los productos naturales marinos es la aplicación de estos como agentes antifouling, la cual presenta un vertiginoso ascenso en su desarrollo, debido a la creciente necesidad de encontrar soluciones efectivas y ambientalmente inocuas para hacer frente a las problemáticas actuales en la industria marítima, siendo una línea de investigación aplicada, enfocada en la búsqueda de organismos capaces de sintetizar metabolitos que presenten un efecto inhibidor, repelente o anestésico en el asentamiento y desarrollo de la incrustación, sin causar serios impactos ambientales (Fusetani,
29 2004). La diversidad estructural de los compuestos encontrados en organismos marinos es uno de los principales focos de la investigación en esta área. Las investigaciones actuales sobre este tema están enfocadas hacia la búsqueda de compuestos amigables con el medio ambiente. Se ha puesto énfasis en la identificación de principios activos existentes en organismos que naturalmente no presentan epibiontes y que han desarrollado mecanismos de inhibición o repulsión para proteger su superficie corporal (Harder, 2009) o bien en aquéllos que han desarrollado defensas químicas contra predadores, por lo que se asume que los metabolitos secundarios son potenciales agentes antifouling (Davis y Wright, 1989; Clare et
al., 1992, Pawlik, 1992; Abarzua y Jakubowski, 1995; Clare, 1996; da Gama et al., 2002; Rao et al.,
2007). El efecto que provocan en los organismos del fouling es variado, numerosos compuestos actúan como anestésicos, otros como repelentes de la fijación o como inhibidores de las propiedades que determinan los mecanismos de la adhesión sin tener efectos biocidas (Omae, 2003).
En los últimos veinte años una amplia variedad de compuestos naturales extraídos de organismos marinos han sido identificados como inhibidores del asentamiento de Balanus
amphitrite y de otros organismos del fouling, como por ejemplo diterpenos del “orejón de mar” Renilla reniformis (Keifer et al., 1986), pukalidos del coral Leptogorgia virgulata y otros
gorgonáceos (Gerhart et al., 1988; Vrolijk et al., 1990; Wahl et al., 1998), compuestos obtenidos de esponjas (Sarma et al., 1991; Goto et al., 1993; Thirionet et al., 1998; Hellio et al., 2005; Dobretsov et al., 2005; Nogata y Kitano, 2006), ácido cinámico del alga Zostera marina (Todd et
al., 1993), juncelinas del octocoral Juncella juncea (Avelin et al., 1993), furanonas, ácido isetiónico
y floridósidos de algas rojas (de Nys et al., 1995; Hellio et al., 2004; de Nys et al., 2006), florotaninos de algas pardas (Ragan y Glombitza, 1986), compuestos fenólicos (Lau y Qian, 2000), extractos de briozoos (Kawamata et al., 2006) y extractos de nudibranquios (Nogata y Kitano, 2006).
Entre las categorías de organismos marinos más prolíferos en términos de producción de metabolitos secundarios se encuentran los poríferos, cnidarios, clorofitos, moluscos, rodofitos, chordados, cyanobacterias y equinodermos que sumados son el 95% de especies en las cuales se ha trabajado en el campo de los productos naturales, mientras que los restantes 14 filos marinos corresponden al 5% en los que se ha reportado el aislamiento de metabolitos. Los filos que atraen más la atención son aquellos que tienen vida sésil dada la facilidad de captura, a que regularmente son visibles por su coloración y a que alcanzan un tamaño adecuado cuando la cantidad de muestra es importante para el análisis de su contenido metabólico. Esta es una muy buena explicación del porque las esponjas cuentan con el mayor numero de reportes 33% de artículos sobre el tema, mientras que los cordados cuentan con apenas 8% y los equinodermos con el 5%, por lo tanto no es una sorpresa que el número de compuestos reportados como aislados de estos fila sea excepcionalmente alto en el caso de las esponjas (6.668) mientras que respecto a los equinodermos y cordados este número es muy similar (1.047 y 977 respectivamente) (Blunt et al., 2008).
30 Sin embargo, si bien la acción antiincrustante de estos compuestos ha sido ampliamente comprobada su incorporación a pinturas no ha sido concretada. Esta diversidad hace de los productos naturales marinos una rica fuente de metabolitos secundarios activos en una amplia variedad de bioensayos como los que se desarrollaron en este trabajo cuyo objetivo fue identificar y evaluar compuestos de origen natural con actividad antifouling para ser aplicados en pinturas antiincrustantes amigables con el medio ambiente con potencial aplicación en embarcaciones y otras estructuras sumergidas. Estos compuestos abarcan una amplia variedad de clases de productos químicos derivados de las rutas biosintéticas de los isoprenoides, shikimatos, acetogeninas, amino ácidos y ácidos nucléicos (Houssen y Jaspars, 2006). Las rutas de biogénesis de metabolitos secundarios más usuales en el medio marino son las de los isoprenoides, acetogeninas y amino ácidos, las esponjas de la clase Demospongiae (a la cual pertenecen todas las esponjas estudiadas en este proyecto) siguen particularmente esta tendencia ya que, según Harper et al. (2001), el 50% de los metabolitos secundarios reportados para las especies de dicha clase pertenecen al grupo de los isoprenos, el 25% son derivados de amino ácidos y el 22% son acetogeninas.
Los miembros de la clase Demospongia están divididos en tres sub‐clases, Tetractinomorpha, Ceractinomorpha y Homoscleromorpha, esta última con muy pocos reportes de estudios en productos naturales dado que es un grupo muy primitivo de organismos y cuenta con pocas especies. Entre las especies de esponjas, estudiadas en este proyecto, el 75% pertenecen a la subclase Ceractinomorpha y el 25% restante son Tetractinomorphas, estas dos últimas a su vez están constituidas por 12 órdenes de los cuales se estudiaron individuos pertenecientes a los siguientes siete, Hadromerida, Spirophorida, Agelasida, Halichondrida, Haplosclerida, Poecilosclerida y Verongida. En la Figura 5 se muestran algunos de los metabolitos que se han reportado para especies de estos órdenes (Harper et al. 2001).
En la esponja Agelas sp. se reportó el aislamiento del alcaloide nagelamida (1) este tipo de metabolito es usual en el orden Agelasida, este orden además de derivados de amino ácidos es productor de isoprenos pero en menor proporción (Kubota et al. 2008), en el caso de la neopetroxiamina (2), este pertenece a un grupo de compuestos nitrogenados propios del genero
Neopetrosia llamados aminas policíclicas, estos compuestos nitrogenados son comunes también
en todo el orden Haplosclerida (Morinaka y Molinski 2011) sin embargo mayoritariamente se encuentran las acetogeninas y los isoprenoides, el compuesto 3 por su parte es un macrolido derivado de la ruta de las acetogeninas aislado de la esponja Spirastrella coccinea que es característico de esta especie (Williams et al. 2007), sin embargo en el orden Hadromerida al cual pertenece es más común encontrar compuestos de tipo isopreno. El alcaloide netamine (4) (Sorek et al., 2006) es una derivado de los aminoácidos que se distingue por ser un policiclo derivado de la guanidina, característico del genero Crambe sin embargo se puede encontrar en distintas especies del orden Poecilosclerida, en tanto que el compuesto 5 es un esteroide aislado de un espécimen del genero Cinachyrella (Rodríguez et al., 1997).
31 Figura 5. Estructura química de algunos metabolitos encontrados en especies del mismo género que las esponjas estudiadas.
La búsqueda de los agentes antifouling requiere separar sustancias a partir de los tejidos de los organismos para su posterior evaluación. Para la primera etapa, denominada de extracción o separación, primero se realiza la maceración o corte del tejido en pequeñas porciones, seguido de la adición de solventes orgánicos (escogidos de acuerdo a las sustancias que se requieran aislar) y posterior filtrado o centrifugado de la muestra obtenida. Aunque hay métodos de mayor complejidad, la mayor parte de la literatura científica reporta aproximaciones que aplican esquemas de extracción de poca complejidad y menor costo (Selvin y Lipton, 2004; Dobretsov et
al., 2005; Limna Mol et al., 2009; Mayzel et al., 2009), que buscan identificar si lo extractos
presentan o no entre sus compuestos asociados actividad inhibitoria frente al asentamiento de organismos incrustantes, con el fin de identificar candidatos para la realización de estudios posteriores encaminados a identificar la molécula o moléculas que tienen esta propiedad.
La evaluación de la capacidad de los extractos para inhibir el asentamiento se puede efectuar desde diferentes aproximaciones y con diferentes objetivos, ya sea utilizando ensayos en laboratorio que hagan uso de organismos representativos de la comunidad incrustante (cirripedios, bivalvos, briozoos y algas) (Briand, 2009) o ensayos en campo de amplio espectro que pueden arrojar información acerca del desempeño del extracto en condiciones de flujo naturales y expuesto a todo el gremio potencial de colonizadores en el área donde se ejecuta el ensayo (Henrikson y Pawlik, 1995), constituyendo una alternativa ecológicamente relevante para evaluar los efectos de inhibición del asentamiento de los metabolitos secundarios de organismos marinos (Henrikson y Pawlik, 1998).
Dentro de los ensayos de laboratorio está el test de toxicidad con nauplii de cirripedios (Balanus
32 permitiendo establecer si los compuestos ensayados son tóxicos y a que concentración (Rittschof
et al., 1992; Clare, 1998; Clare et al., 1999; Maréchal et al., 2004; Löschau y Krätke, 2005; Qiu et al., 2005, Blustein et al., 2009). También se realiza el test de asentamiento con cypris de B. amphitrite a las 24, 48 y 72 horas, en el cual se evalúa el potencial de una sustancia para inhibir la
fijación del 50% de la población en estudio (EC50).
El método de incorporación de extractos en una matriz de gel inerte y estable, es uno de los ensayos en campo de creciente importancia, el cual permite capturar una impresión de la comunidad incrustante, caracterizando los grupos presentes en el área y cuantificando el efecto del extracto en términos de presencia/ausencia de organismos o cobertura de organismos asentados sobre el gel con el extracto incorporado (Henrikson y Pawlik, 1995). Sin embargo, los resultados de cuantificación deben ser evaluados bajo la luz de las evidencias de variabilidad en la composición y abundancia relacionadas con los regímenes climáticos, aportes de agua dulce a la plataforma continental y fenómenos de surgencia que alteran la composición del plancton (Franco‐Herrera et al., 2006), ocasionando variaciones en los patrones de reclutamiento larval en las diferentes especies que componen el gremio incrustante, afectando la intensidad de este evento considerado continuo a lo largo del año en regiones tropicales, atribuyéndole periodicidad a los picos de reclutamiento por especie (García y Salzwedel, 1993). El otro método utilizado para evaluar el potencial en campo fue incorporar las fracciones orgánicas de los extractos seleccionados mediante la prueba del gel, en una matriz soluble con la cual se pintan paneles de acrílico y se sumergen en el mar. Este método permite determinar si el efecto observado en los ensayos tiene aplicación práctica en el campo del control del biofouling utilizando pinturas (Blustein et al., 2005; Pérez et al., 2006).
Con el fin de generar opciones que puedan sustituir los compuestos tradicionalmente empleados en las pinturas protectoras utilizados por la industria marítima, para barcos y otras estructuras sumergidas, los cuales son altamente tóxicos; se desarrolló este proyecto en el cual mediante la evaluación de los bioensayos de laboratorio y de campo expuestos anteriormente, se identificaron al menos, cinco fracciones orgánicas producto de organismos marinos con actividad
antifouling potencialmente incorporables en pinturas antiincrustantes amigables con el medio
ambiente.
33
1.2
METODOLOGÍA
1.2.1 Área de estudio
El estudio fue desarrollado en inmediaciones de Santa Marta en el Caribe colombiano y de Mar del Plata en el Atlántico argentino. El área de estudio en Colombia incluye diferentes localidades a lo largo de la zona costera del Distrito Turístico, Cultural e Histórico de Santa Marta, en el departamento del Magdalena, al norte del territorio colombiano, entre la bahía de Nenguange en el Parque Nacional Natural Tayrona, y las playas del Aeropuerto en el extremo sur del perímetro urbano de la ciudad de Santa Marta (Figura 6). Figura 6. Área de estudio del proyecto (mapa realizado en el LABSIS del INVEMAR). Esta franja costera forma parte del límite continental superficial y geográfico de la Sierra Nevada de Santa Marta (SNSM) con el mar Caribe, está formada principalmente de roca cohesiva y depósitos arenosos que forman playas extensas. En general el clima del sector es estacional pero presenta marcados contrastes entre el norte y el sur del litoral que, junto con las particularidades geo‐morfológicas del área, condicionan las características de sus ecosistemas (Márquez, 1982).
34 La época de precipitaciones se presenta entre los meses de mayo y junio, alternando con una época de sequía que termina en agosto, luego de la cual sucede la segunda temporada lluviosa del año, en la que el nivel de precipitaciones llega a su máximo y se extiende hasta diciembre, en esta fecha la llegada de los vientos alisios que bajan de la SNSM da lugar a un nuevo periodo de sequía que se prolonga hasta abril. Los fuertes vientos característicos de la estación seca tienen alguna influencia en el desplazamiento de las aguas superficiales costeras permitiendo el ingreso de aguas más profundas y frías que transportan nutrientes así como también modifican la turbidez y la salinidad de las aguas costeras, su influencia más notoria ocurre desde la bahía de Nenguange hasta la bahía de Santa Marta, mientras que en la parte sur del área de estudio su influencia no es tan fuerte y en cambio, el movimiento de las masas de agua en esta zona obedece a un ciclo diurno en el que el viento esta en dirección mar tierra y durante la noche se invierte (Márquez, 1982; Vides y Sierra‐Correa, 2003; Posada y Henao 2008).
En la zona norte durante los regímenes de lluvias se han reportado precipitaciones anuales que pueden llegar hasta los 1.000mm predominando el monte espinoso tropical como ecosistema terrestre, la línea de costa está caracterizada por la presencia de bahías y ensenadas, que alcanzan profundidades hasta de 20m muy cerca de la orilla, consecuencia de la pendiente pronunciada de la serranía, se encuentran cercadas por acantilados escarpados de rocas metamórficas que encierran playas arenosas pequeñas y lagunas costeras en las que se pueden encontrar bosques de manglares de regular tamaño; en la época de lluvia se forman pequeños afluentes que deslizan sedimentos desde el continente y contribuyen al desarrollo de praderas de fanerógamas y franjas o parches de arrecifes en los cuales las esponjas y otros organismos marinos prosperan con gran éxito, es de hecho un territorio excepcional por contar con representaciones de todos los ecosistemas marino‐costeros (Márquez; 1982, Posada y Henao 2008; INGEOMINAS, ECOPETROL ICP, INVEMAR, 2008; Cardona 2010).
De otra parte, la zona sur del área de estudio, comprendida después de El Rodadero, empieza a formar parte del margen occidental de la unidad geológica ígnea “Batolito de Santa Marta”; está caracterizada por la prolongación de llanuras costeras y, en el litoral, playas de arenas formadas por depósitos fluviomarinos, la principal diferencia con la zona norte es que esta presenta un nivel de precipitaciones menor, alcanzando los 500mm al año, y la vegetación continental se encuentra en la transición de monte espinoso tropical hacia el bosque muy seco tropical, los afluentes dulceacuícolas como los ríos Manzanares, Gaira y Córdoba cargan con un volumen de agua mayor que el de la zona norte y traen consigo sedimentos y nutrientes en grandes cantidades lo que provoca un aumento de la turbidez y disminución de la penetración de la luz, esto incide directamente en la formación de sistemas arrecifales que son muy escasos en esta parte del área de estudio (Márquez, 1982; Posada y Henao 2008; INGEOMINAS, ECOPETROL ICP, INVEMAR, 2008). Algunos organismos filtradores como las esponjas prosperan con gran éxito en la parte noroccidental de la Bahía de Santa Marta hacia el costado norte de la saliente de Punta Betin y en la isla de El Morro, en donde las surgencias estacionales y las descargas de aguas continentales promueven su crecimiento a profundidades entre 8‐25m (Zea, 1994).
35 Dentro de esta área en la Bahía de Santa Marta se encuentra localizado el puerto de Santa Marta en inmediaciones del cual se encuentra ubicada una estación de trabajo en la cual se realizaron los bioensayos en campo. La estación de bioensayos está ubicada entre el muelle carbonífero y Punta de Betín a ocho metros de profundidad en donde se realizaron los ensayos de actividad
antifouling en campo.
La zona de estudio en Argentina está ubicada en el puerto de Mar del Plata, la cual es una zona de ultramar y se encuentra situada al sur de Cabo Corrientes (38°08’S – 57°31’W). Está delimitada por dos escolleras cuya boca de acceso, de 300m de ancho, está orientada hacia el noreste, ocupando un área de aproximadamente 2.000m de largo por 1.100m de ancho (Figura 7). La profundidad varía a lo largo de todo el puerto; sin embargo, se tiende a mantener un dragado aproximadamente de 8m. Los sedimentos en toda la zona que recibe influencia externa son de granulometría fina a mediana, con variaciones más o menos marcadas a lo largo del año. En el resto del puerto los sedimentos presentan un alto contenido de materia orgánica debido especialmente a los aportes de los desagües industriales y sanitarios de la zona. Las aguas sufren una variación térmica anual de aproximadamente 12°C, lo que indudablemente tiene una influencia marcada sobre el desarrollo de la comunidad incrustante. Está dedicado fundamentalmente a la actividad pesquera y secundariamente al transporte de petróleo, de cereales y a la actividad turística. El lugar de muestreo utilizado para llevar a cabo las experiencias es el Club de Motonáutica ubicado en el interior del puerto. Los bastidores se colgaron de las marinas a una profundidad de 50cm.
36
1.2.2 Especies evaluadas
Las esponjas pertenecen al Phylum Porifera y son organismos fundamentalmente marinos, cuya principal característica es la multicelularidad, sin llegar a formar tejidos verdaderos, ni órganos, ni estructuras sensoriales. Su estructura está constituida por poros y canales, a través los cuales fluyen las corrientes de agua utilizadas para realizar la mayor parte de sus funciones. Son organismos sésiles, filtradores, y en su mayoría asimétricos; excepto algunas especies menos complejas con simetría radial (Mille, 2008). La Tabla 2 muestra la clasificación taxonómica de las esponjas utilizadas para este estudio. Tabla 2. Clasificación taxonómica de las esponjas evaluadas (Zea, 1987; Hooper y Soest, 2002; Soest y Hooper, 2005; Felder y Camp, 2009). Phylum Porifera Clase Demospongie Subclase Tetractinomorpha Orden Hadromerida Familia Spirastrellidae Género Spirastrella Spirastrella coccinea (Duchassaing y Michelotti, 1864) Orden Spirophorida Familia Tetillidae Género Cinachyrella Cinachyrella kuekenthali (Uliczka, 1929) Subclase Ceractinomorpha Orden Agelasida Familia Agelasidae Género Agelas Agelas tubulata Lenher y Soest, 1996 Orden Halichondrida Familia Heteroxyidae (=Desmoxyidae) Género Myrmekioderma Myrmekioderma gyroderma (Alcolado, 1984) Orden Haplosclerida Suborden Petrosina Familia Petrosiidae Género Neopetrosia Neopetrosia proxima (Duchassaing & Michelotti, 1864) Familia Phloeodictyidae Género Oceanapia Oceanapia peltata (Schmidt, 1870) Orden Poecilosclerida Suborden Mycalina Familia Desmacellidae Género Biemna Biemna cribaria (Alcolado y Gotera, 1986) Orden Verongida Familia Aplysinidae Género Aplysina Aplysina lacunosa (Pallas, 1766)
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Spirastrella coccinea
El género Spirastrella se caracteriza por presentar capas densas de espículas denominadas espirastrellas (Hooper, 2002). Tiene forma de lunar con tendencia a formar parches, de naturaleza incrustante con espesor entre 1‐5mm. El color varía de rojo a naranja rojizo o marrón, con consistencia y superficie dura, ligeramente comprimible; al tacto, lisa, correosa y ligeramente corrugada; convexa y a veces con pequeños agujeros con cuerpos silicios estrelliformes que sobresalen en la superficie (Figura 8) (Duchassaing y Michelotti, 1864; Hechtel, 1965; Collin et
al., 2005). Sinonimo: Thalysias coccinea. Se distribuye en la mayor parte del Caribe hasta el
noreste del Golfo de México (Costa Rica, Panamá, Colombia, Venezuela, Antillas, Florida) excluyendo la parte central del Golfo de México (Duchassaing y Michelotti, 1864; Rützler et al., 2009; Miloslavich et al., 2010). Figura 8. Spirastrella coccinea (Foto S. Zea).
Cinachyrella kuekenthali
El género Cinachyrella es un grupo de esponjas de forma globular con porocálices, sin corteza y sin espículas accesorias. La especie C. kuekenthali presenta la forma típica del género y puede llegar a los 150‐200mm de diámetro, con coloraciones que van de naranja a amarillo opaco y su interior amarillo intenso (Figura 9). Las tonalidades marrones son debidas a algas filamentosas o cianobacterias en la superficie. (Rützler y Smith, 1992). Sinónimos: Cinachyra kuekenthali,Cinachyra schistospiculosa, Uliczka schistospiculosa. Se distribuye desde Carolina del Norte (USA)
(34° latitud Norte) atravesando las Indias occidentales hasta el noreste de Brasil (1° latitud Norte), incluyendo las Bahamas, el suroeste de Florida, Puerto Rico, Jamaica, Belice y Colombia. Son características de ambientes coralinos de mediana energía a profundidades de 4‐20m, pero también en fondos duros hasta los 100m (Rützler y Smith, 1992).
Agelas tubulata
En el género Agelas las especies se caracterizan por tener estilos con filas de espinas con espacios más o menos regulares como el único tipo de espícula presente. A. tubulata (Figura 10) se caracteriza por aparecer en racimos que pueden superar los 20cm de altura, con forma de tubo,38 con aberturas de 5‐8cm de diámetro, coloración amarillo‐naranja, con una superficie lisa y de consistencia elástica y comprimible (Lehnert y Soest, 1996). Se distribuye ampliamente en el Caribe siendo reportada en Belice, Cuba, Islas Caimán, Antillas mayores y Venezuela (Lehnert y Soest, 1996; Miloslavich et al., 2010). Figura 9. Cinachyrella kuekenthali (Foto S. Zea). Figura 10. Agelas tubulata (Foto S. Zea).
Myrmekioderma gyroderma
El género Myrmekioderma se caracteriza por generar formaciones incrustantes o masivas, presentando una superficie híspida, con meandros excavados característicos, canales sinuosos o derechos y surcos, formando en ocasiones platos tuberculados poligonales (Hooper, 2002). Sinónimos: Topsentia gyroderma. La especie M. gyroderma (Figura 11) puede presentar forma lobulada o no, o de cojín, alcanzando en ocasiones gran espesor, con ósculos de 4‐10cm sin posición determinada, tiene coloraciones que van desde amarillo a naranja brillante, de superficie irregular y consistencia firme, elástica y algo grumosa al tacto (Alcolado, 1984). Tiene amplia distribución para el Caribe, las Antillas mayores, Colombia, Panamá, Golfo de México (Alcolado, 1984; Miloslavich et al., 2010).
39 Figura 11. Myrmekioderma gyroderma (Foto S. Zea).
Neopetrosia proxima
El género Neopetrosia se caracteriza por incluir especies de carácter compacto con una superficie finamente híspida, lisa y de tacto aterciopelado, de consistencia dura casi rocosa, de tamaños y formas irregulares (Desqueyroux‐Faúndez y Valentine, 2002a). Sinónimos: Thalysias proxima,Densa araminta, Neofibularia proxima, Xestospongia proxima. La especie N. proxima (Figura 12)
se presenta como incrustaciones, como lóbulos digitiformes erectos con ápices engrosados, o masas aplastadas a subesféricas. Superficie puntiforme, microhíspida, en general llena de detritos. Su coloración es comúnmente café con tonos purpura o violeta oscuro a claro. Lados no expuestos e interior crema. La consistencia es firme, dura, algo difícil de quebrar y cortar, exudando mucus pegajoso al tacto (Zea, 1987). Se distribuye en Colombia (Urabá, Cartagena, Santa Marta), Brasil, Puerto Rico y Las Islas Vírgenes (Zea, 1987).
Figura 12. Neopetrosia proxima (Foto S. Zea).
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Oceanapia peltata
El género Oceanapia lo constituyen especies de forma masiva, globular o lamelada, con largos procesos tubulares o fistulas, abiertos o cerrados en sus extremos (Desqueyroux‐Faúndez y Valentine, 2002b). Sinónimos: Foliolina peltata. Se describe como una especie globular masiva, que suele encontrarse incrustada en la arena; presenta proyecciones cilíndricas fistulares que sobresalen de la arena y tienen extremos lisos o proyecciones con forma de pagoda, con 2‐4cm de ancho y 1mm de espesor, con coloración crema o grisácea (Figura 13). La consistencia del glóbulo corporal es ligeramente comprimible y bastante fibrosa si se intenta cortarla, por otra parte las fistulas al tacto son lisas, más suaves y menos fibrosas (Collin et al., 2005). La especie es registrada a 50‐100m de profundidad, en Colombia, Florida, Cuba y Bocas del Toro (Panamá) (Collin et al., 2005). Figura 13. Oceanapia peltata (Foto S. Zea).
Biemna cribaria
El género Biemna se caracteriza por presentar especies masivas, con forma de copa o tubulares, con una superficie desigual. Con estilotes o megascleras arregladas a manera de plumoreticula. Ectosoma con esqueleto constituido por tractos coanosomales de extremos cepillados (Hajdu y Soest, 2002). Sinónimos: Biemna oxeata, Neofibularia cribaria. La especie B. cribaria (Figura 14) se caracteriza por presentar forma de una gran masa subesférica de alrededor de 50cm de diámetro, con varias zonas donde se agrupan los ósculos formando cribas; estas zonas osculares están algo elevadas. En dichas zonas, entre los ósculos, se encuentran elevaciones algo cónicas o digitiformes, de aproximadamente 5mm de altura y 1‐3mm de ancho, algunas de las cuales son compuestas. Color pardo oscuro en la superficie y beige en el coanosoma. Consistencia dura, quebradiza y desmenuzable; las elevaciones mencionadas son algo más flexibles (Alcolado y Gotera, 1986). En el Caribe se registran estudios que la describen para las Antillas mayores (Jamaica y Cuba), Colombia y Barbados (Van Soest y Stentoft, 1988; Lehnert y Soest, 1996, 1998; Arias et al., 2006).41
Figura 14. Biemna cribaria (Foto S. Zea).
Aplysina lacunosa
El género Aplysina se caracteriza por la presencia de fibras de una sola clase, sin detritos exógenos y por la presencia de un grueso componente medular. Las fibras forman un retículo regular con grandes mallas poligonales y no hay arreglo superficial especializado (Bergquist y Cook, 2002). Sinónimos: Verongia lacunosa, Verongia sebae, Aplysina nuciformis, Aplysina sebae,
Luffaria nuciformis, Luffaria sebae, Spongia lacunosa. La especie A. lacunosa (Figura 15) forma
tubos solitarios o en grupos de hasta unos 50cm de altura y 4‐10cm de diámetro. Pared gruesa de 1,5‐2,3cm e incluso superior. Su coloración es amarillo intenso, con tonos rojizos o verdosos, a veces muy oculto por la epibiosis. Es una especie de consistencia firme, poco compresible y en especímenes muy grandes son más flexibles y blandos (Zea, 1987). Se distribuye en Colombia (Urabá, Cartagena, Santa Marta, Providencia), Bahamas, Florida, Jamaica, Puerto Rico, República Dominicana, Curazao y Bonaire (Zea, 1987).
Figura 15. Aplysina lacunosa (Foto S. Zea).
42 Las ascidias pertenecen al phylum Chordata, subphylum Urochordata, son conocidos como tunicados y se caracterizan por presentar notocorda. Sus formas son ampliamente variables y muchas especies forman colonias o agregados (Nielsen, 2001). Estos organismos son de hábito exclusivamente marino y están presentes en todos los océanos, desde las zonas intermareales hasta las profundidades abisales del océano (Tatiàn et al., 2005). Existen aproximadamente 1.250 especies, organizadas en cuatro clases: dos clases planctónicas Thaliacea y Larvacea también denominada Appendicularia y dos clases bentónicas Ascidiacea y Sorberacea (Nielsen, 2001; Moore, 2006). La clase Ascidiacea se caracteriza por presentar una gruesa túnica que puede ser única para organismos solitarios, o compartida en los coloniales; son filtradores, hermafroditas; con reproducción sexual en organismos solitarios y sexual o asexual en los coloniales. Sus dimensiones suelen ser variadas según la especie y el lugar donde se desarrollan, desde milímetros hasta varios centímetros. Suelen vivir fijos a sustratos consolidados, en aguas poco profundas o a grandes profundidades, pero sus larvas son de vida libre, con un corto periodo de vida planctónica (Nielsen, 2001; Bonnet, 2010).
Phallusia nigra
La especie pertenece al orden Phlebobranchia y a la familia Ascidiidae. Phallusia nigra Savigny, 1816, es un tunicado solitario, muy conspicuo, de coloración de azul índigo‐negro a marrón oscuro‐negro pigmentación que colorea la mayor parte de los órganos internos y la testa, con textura correosa (Figura 16). El cuerpo está elongado moderadamente y se fija al sustrato por la parte posterior y algunas veces por el lado izquierdo. Las papilas son bífidas en sus extremos. Aparecen de cinco a seis estigmas en una malla y el saco exhibe pequeñas ondulaciones o pliegues entre las barras longitudinales internas. Los tentáculos son numerosos y delgados, de muchos tamaños, arreglados con algún grado de regularidad. El tubérculo dorsal generalmente tiene una abertura en forma de U (Van Name, 1901; Kaplan, 1999; Rocha et al., 1999). Sinónimos:
Ascidia atra, Ascidia nigra, Ascidia somalensis, Phallusia atra, Phallusia violácea, Phallusiopsis nigra, Thallusia nigra (errata), Tunica nigra.
Figura 16. Phallusia nigra, (Smithsonian Marine Station at Fort Pierce ‐ Foto L. Holly Sweat).
43 Los organismos pertenecientes al Phylum Echinodermata son organismos marinos, con una alta diversidad, que se distribuyen desde las zonas intermareales hasta las grandes profundidades y son habitantes de todas las regiones climáticas del mundo. Se caracterizan por ser invertebrados de simetría birradial secundaria, eje principal corporal oral‐aboral y forma del cuerpo variable (a manera de flor, estrella, globular o de gusano) (Nielsen, 2001). Son organismos bentónicos de vida libre en su mayoría, con sólo un grupo que conserva el carácter sésil. Los equinodermos se clasifican en cinco clases bien definidas que son: Crinoidea, Asteroidea, Ophiuroidea, Echinoidea, Holothuroidea (Smith, 1984). Los Holothuroidea, conocidos como pepinos de mar con aproximadamente 900 especies (Moore, 2006), que se distribuyen desde el litoral hasta los 6.000m de profundidad, presentan un tamaño moderado y corresponden al grupo cuya simetría es bilateral, ya que su plan corporal es elongado con su madreporito y ano posicionados en los extremos del cuerpo. Son alimentadores de suspensión o de depósito, con una alta selectividad en el consumo del material orgánico ingerido (Mille, 2008).
Holothuria (Selenkothuria) glaberrima
La especie pertenece al orden Aspirochirotida y a la familia Holothuridade, Holothuria (Selenkothuria) glaberrima Selenka, 1867 es una especie pequeña, que alcanza una longitud máxima de aproximadamente 15 cm, con cuerpo cilíndrico y piel suave, con gran cantidad de pies ambulacrales en la superficie ventral, presentando también papilas dorsales pequeñas e inconspicuas y tentáculos largos muy ramificados y dendríticos (Figura 17). Son de hábitos gregarios, llegándose a encontrar varios individuos en zonas donde su avistamiento es común y habitan típicamente zonas litorales de baja marea, donde se presente la acción del oleaje (Lewis, 1960; Hendler et al., 1995). Su distribución se extiende al sur de las Islas Bahamas y en el Caribe occidental hasta Trinidad y en las costas de Colombia (Tierra Bomba, Cartagena; Punta de la Loma, Santa Marta) hasta México (Lewis, 1960; Caycedo, 1978; Hendler et al., 1995).
Figura 17. Holothuria (Selenkothuria) glaberrima (Foto E. Ortiz).
44
1.2.3 Recolección de muestras
Para este estudio fueron colectadas en total 10 especies de invertebrados marinos, nueve poríferos, un cordado y un equinodermo. Estos organismos se reproducen con gran éxito a lo largo de la franja costera en la que se desarrolló este estudio y su colecta es relativamente sencilla dada la cercanía a la costa y la profundidad en la que se encuentra su hábitat. Con anterioridad, en el INVEMAR se han estudiado los extractos de algunas de las especies reportadas en este estudio, encontrando que poseen actividad interesante como inhibidores del crecimiento de bacterias patógenas o levaduras o la inhibición del asentamiento de macroepibiontes en geles inertes, razón por la cual fueron seleccionadas con el fin de avanzar en la detección del principio activo de su actividad biológica frente a este último fenómeno. Los organismos sobre los que no existen estudios previos se seleccionaron basados en información bibliográfica sobre actividad antifouling de especies de grupos similares a las que se encuentran en la zona, como es el caso de los pepinos de mar y las ascidias. Lo anterior en el marco de la propuesta técnica del Plan Nacional de Bioprospección (Melgarejo et al., 2002), dando continuidad a los hallazgos de Arias et al. (2006) y los resultados del proyecto de Colciencias identificado con código 21050912456.
Los invertebrados estudiados se obtuvieron mediante colecta manual en sustratos naturales o artificiales (Tabla 3) con equipo autónomo de buceo o a pulmón. En el caso de las ascidias, estas fueron obtenidas de artes de cultivo empleadas en maricultura de bivalvos o langostas, que son llevadas a la playa para labores de limpieza rutinarias luego de permanecer en el mar de tres a once meses y en las cuales se encuentran adheridas una gran diversidad de organismos. Los pepinos de mar utilizados fueron colectados en el litoral rocoso para desarrollar una tesis de maestría sobre la biología reproductiva, en el cual solo se utilizaban las gónadas, por lo que el resto del cuerpo fue aprovechado para avanzar en el conocimiento de los mecanismos de defensa químicos de estos organismos.
Tabla 3. Información de las estaciones de colecta de las muestras.
Estación Ubicación Sustrato Organismos
Nenguange 11°19'41.95"N 74° 4'50.98"O Cultivo de bivalvos Ascidias Bahía Concha 11°19'10.05"N 74° 9'36.58"O Arrecife Esponjas Punta Aguja 11°18'53.81"N 74°11'38.69"O Arrecife Esponjas
Granate 11°18'5.28"N 74°11'40.45"O Arrecife Esponjas
Punta Las Minas 11°16'26.68"N 74°12'23.55"O Arrecife Esponjas Playa Grande 11°16'14.45"N 74°12'2.37"O Cultivo de langosta Ascidias Taganga 11°16'5.81"N 74°11'39.41"O Fondo rocoso Pepinos El Morro 11°14'57.56"N 74°13'48.22"O Arrecife Esponjas Punta Betín 11°15'1.02"N 74°13'16.09"O Arrecife Esponjas Inca‐Inca 11°12'35.56"N 74°14'10.36"O Fondo rocoso Pepinos El Rodadero 11°12'27.02"N 74°13'47.74"O Fondo rocoso Pepinos Punta Loma 11°7'34.54"N 74°13'59.53"O Fondo rocoso Pepinos
45 En el momento de la colecta se registraron los datos de campo con información de la zona, la fecha, la profundidad, el tipo de sustrato, y en el laboratorio de peso y volumen del tejido obtenido. Una vez colectadas las muestras fueron introducidas en bolsas herméticas, y transportadas en cavas refrigeradas a las instalaciones del INVEMAR donde se identificaron y almacenaron. Ya en el laboratorio se retiró el exceso de agua de las bolsas, se coloco dentro de ellas un rótulo con el nombre de la especie, profundidad, localidad fecha y colector, además se tomó el peso del material colectado. La medición volumétrica, se realizó a partir de fragmentos de aproximadamente 50g del organismo limpio en húmedo, por desplazamiento de agua en una probeta de 250ml, con lo que se determinó la relación masa/volumen, que dio finalmente el volumen total de la muestra colectada (Newmark et al., 2005); los fragmentos que se emplearon en esta medición fueron usados como ejemplares testigo fijándolos en alcohol al 70% para depositarlos en el Museo de Historia Natural Marina de Colombia (MHNMC), como material de referencia, en donde se generó el correspondiente número de catálogo (Tabla 4). Tabla 4. Registros de la colecta de organismos. Cód. Especie Fecha de colecta Localidad Prof. (m) Peso (g) Colector Nº Cat. MHNMC Ck1 Cinachyrella kuekenthali 16‐05‐09 Punta Betín 11 660,20 S. Zea INV POR1150 Np3 Neopetrosia proxima 01‐06‐09 Punta Las Minas 17 451,97 S. Zea INV POR1154
At7 Agelas tubulata 05‐03‐09 P. Betín 15 303,80 S. Zea INV POR1163
Al9 Aplysina lacunosa 22‐04‐09 P. Betín 8 885,60 S. Zea INV POR1166
Bc16 Biemna cribaria 10‐10‐10 Granate 15 1.637,00 S. Zea INV POR1176 Sc18 Spirastrella coccinea 10‐08‐10 P. Aguja/El Morro 18‐21 894,10 S. Zea INV POR1178 Mg19 Myrmekioderma
gyroderma 10‐08‐10 P. Aguja 23‐25 2.948,90 S. Zea INV POR1182
Bc20 Biemna cribaria 10‐08‐10 El Morro 21 2.292,70 S. Zea INV POR1177
Np21 Neopetrosia proxima 10‐08‐10 P. Aguja 24 1.062,70 S. Zea INV POR1155
Hg25 Holothuria glaberrima 29‐01/26‐ 07‐10
Taganga / Inca Inca / El Rodadero / Punta Loma
0,5‐1 2.790,00 E. Ortiz Por ingresar At26 Agelas tubulata 04‐02‐11 P. Aguja 12‐15 2.281,43 S. Zea INV POR1164 Op27 Oceanapia peltata 04‐02‐11 El Morro 25 894,25 S. Zea INV POR1183 Pc28 Petromica ciocalyptoides 04‐02‐11 Bahía Concha 13‐17 350,96 S. Zea INV POR1185 Sc29 Spirastrella coccinea 04‐02‐11 P. Aguja / El morro 7‐24 859,24 S. Zea INV POR1180 Pn30 Phallusia nigra 12‐02‐11 Playa Grande 8 580,72 C. Puentes Por ingresar
Am31 Ascidia cf
multitentaculata 01/12‐10 Nenguange 8‐16 311,45 C. Puentes Por ingresar Asp32 Ascidia sp. 01/12‐10 Nenguange 8‐16 501,45 C. Puentes Por ingresar Np33 Neopetrosia proxima 19‐10‐09 Granate 18 261,95 S. Zea INV POR1156 Np34 Neopetrosia proxima 26‐11‐09 Granate 18 871,11 S. Zea INV POR1157 Pc35 Petromica ciocalyptoides 10‐06‐11 B. Concha 13‐14 976,80 S. Zea INV POR1187 Op36 Oceanapia peltata 10‐06‐11 P. Aguja/El Morro 12‐25 1.466,80 S. Zea INV POR1184 Sc37 Spirastrella coccinea 10‐06‐11 El Morro 6‐17 922,80 S. Zea INV POR1179 Al38 Aplysina lacunosa 19‐08‐11 P. Betín 8‐10 2634,20 S. Zea INV POR1168
