ENSAYOS IN VITRO DE LA ACTIVIDAD PROTEASA DE Sat DE LA CEPA EcN.

A continuación se abordaron ensayos de actividad enzimática encaminados a confirmar que la proteína Sat de la cepa EcN presenta actividad proteasa y que esta actividad depende de la S256. En paralelo, para comprobar la expresión de Sat a partir de los clones recombinante pSAT y pSAT(S256I), así como para confirmar la disrupción del gen sat en el mutante knockout, se abordaron ensayos de Western blot.

DNA molde EcN (gen sat) TCGGAGACAGCGGCTCTGG Serina 256 FW Mut: TCGGAGACATCGGCTCTGG RW Mut: CCAGAGCCGATGTCTCCGA

128 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Toloza L., Tesis doctoral

Para este estudio se seleccionaron las siguientes cepas: (i) la cepa de laboratorio HB101 (carente de gen sat) transformada con los plásmidos recombinantes pSAT o pSAT(S256I), (ii) el mutante EcNsat::cm, (iii) la cepa mutante EcNsat::cm transformada con los plásmidos pSAT o pSAT(S256I) y (iv) la cepa probiótica EcN como control.

La determinación de la actividad proteasa y el análisis por Western blot fueron realizados a partir de cultivos en fase estacionaria de cada cepa en medio LB en presencia de los antibióticos adecuados. Después de centrifugar los cultivos, los sobrenadantes fueron filtrados y concentrados unas 500 veces con dispositivos Centricon-plus70, con un tamaño de poro de exclusión de 100 KDa.

La actividad proteasa de las fracciones concentradas fue determinada a través de la hidrólisis del sustrato N-Metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitroanilida (Sigma). Este sustrato fue seleccionado en base a resultados publicados sobre la actividad y especificidad de diversas proteasas de la familia SPATE (Dutta et al., 2002). La hidrólisis de este sustrato artificial por acción de proteasas libera el cromóforo p-Nitroanilida

que absorbe a 505 nm. El ensayo se llevó a cabo en placas de 96 multipocillos en un volumen final de 100 l, conteniendo 200 g de proteína (Métodos 4.5.5.2). Las placas se incubaron durante 18 horas a 37_ºC (Figura 5.18A). Como control, la actividad proteasa de las muestras fue determinada también en presencia del inhibidor de la actividad proteasa PMSF a concentración de 1mM. En este caso los sobrenadantes concentrados (200 g totales de proteína) fueron incubados con el inhibidor durante 30 minutos previos a la determinación de la actividad. En todos los casos se observó que la actividad proteasa se inhibia por PMSF.

La immunodetección de la proteína Sat en estas muestras (200 g) fue evaluada mediante análisis por Western blot con anticuerpos anti-Sat. Los resultados de este estudio se presentan en la Figura 5.18B.

La ausencia de banda inmunoreactiva así como de actividad proteasa en el sobrenadante de la cepa HB101 es concordante con la ausencia del gen sat en su genoma. La ausencia de Sat (proteína y actividad) en el mutante EcNsat::cm confirma la correcta disrupción del gen. En consecuencia este mutante resulta un buen modelo para abordar estudios funcionales basados en la deficiencia en Sat.

La actividad proteasa así como la inmunodetección de Sat en los sobrenadantes de la cepa HB101 y del mutante knockout transformadas con el plásmido pSAT confirman que el gen sat de la cepa probiótica EcN codifica una serin proteasa funcional. Estos resultados confirman además el correcto procesado y secreción de la proteína expresada a partir del gen clonado. Este resultado avala la utilización del plásmido recombinante pSAT para analizar los efectos de la expresión Sat en el fondo de la cepa

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Toloza L., Tesis doctoral

probiótica y de cepas de laboratorio. El plásmido pSAT deriva del plásmido pBR322, el cual se mantiene dentro de las células transformadas en unas 20 copias por célula.

Figura 5.18. Actividad proteolítica de Sat sobre el Sustrato Artificial: p-nitroanilida-Ala-Ala-Pro-Val.

(A) La actividad proteasa de Sat fue evaluada en sobrenadantes concentrados, obtenidos a partir de cultivos en LB de las cepas indicadas. Los valores de actividad proteasa (expresados en pmoles/g de proteína) corresponden a la media ±SE de puntos dobles de tres experimentos independientes. (B) Correlación con los niveles de proteína Sat detectados por Western blot. Para la inmunodetección de Sat se utilizaron anticuerpos específicos anti-Sat. Para normalizar los resultados, las muestras ensayadas correspondían en todos los casos a 200 μg de proteína total. *P<0.05, **P=0.000.

En las muestras que contienen una proteína Sat activa, los niveles de actividad enzimática se correlacionan con los de la proteína detectada mediante anticuerpos específicos. Así, los sobrenadantes de las cepas transformadas con el plásmido pSAT presentan niveles superiores de actividad y de proteína inmunoreactiva en comparación con los valores de la cepa probiótica EcN wild-type.

La presencia de proteína Sat en los sobrenadantes de la cepa HB101 y en el mutante

knockout transformadas con el plásmido pSAT(S256I) demuestra la expresión y secreción de la proteína mutada. Sin embargo, dicha proteína Sat S256I no presenta actividad proteasa lo que confirma la funcionalidad de la S256 en el mecanismo catalítico. Esta construcción será de utilidad para valorar la implicación de la actividad proteasa de Sat en los efectos mediados por esta proteína sobre monocapas de células Caco-2 en cultivo.

En conjunto estos resultados demuestran que el gen sat de la cepa probiótica EcN codifica una serin proteasa funcional. Recordar que la proteína Sat de la cepa EcN difiere en 8 residuos de aminoácidos de la proteína Sat de la cepa uropatógena

0 10 20 30 40 50 60 70 80 HB101 HB101 (pSAT) HB101 pSAT(S256I)

EcN EcNsat::cm EcN sat::cm (pSAT) EcN sat::cm pSAT(S256I) pmoles/μgproteín/18 horas

A

B

Sat

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Toloza L., Tesis doctoral

CFT073. Nuestros resultados indican que estas diferencias no anulan la actividad proteasa de Sat de EcN, ni el autotransporte y secreción de la proteína. En las cepas que expresan una proteína Sat activa (a partir del gen cromosómico o clonado en plásmido) los niveles de actividad enzimática se correlacionan con los niveles de proteína Sat sintetizada y secretada.

5.3.5 EFECTO DE LA SERIN PROTEASA Sat SOBRE LA PERMEABILIDAD PARACELULAR