OBTENCIÓN DE CONSTRUCCIONES Y MUTANTES PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE Sat.

5.3.3.1 Clonación del gen sat en el vector pBR322.

El gen sat de EcN fue amplificado mediante PCR con primers que contenían dianas de restricción para las enzimas BamHI y NruI. El segmento amplificado de 4.395 pb (-435 y +3960) comprende la secuencia codificante de la proteína Sat y la región corriente arriba que dirige su transcripción. La proteína expresada a partir de este constructo corresponde a la proteína completa de 142 kDa con los 3 dominios típicos de las proteínas de la familia SPATE. El procesado de esta proteína en células de E. coli dará como resultado la secreción del dominio catalítico de 107 kDa.

Raspado de Mucus

Ratón Control Ratón EcN (PFU34-φsat) Íleon Colon C (+) Íleon Colon

126 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Toloza L., Tesis doctoral

El fragmento amplificado fue clonado en el plásmido pBR322 entre las dianas de restricción BamHI y NruI. Se seleccionó para esta clonación el plásmido pBR322 de bajo número de copias debido a que la sobreexpresión de Sat podría resultar tóxica para los cultivos bacterianos. Células competentes de la cepa DH5α fueron transformadas con el producto de ligación. Los clones recombinantes fueron seleccionados por resistencia a ampicilina y comprobados por PCR. A partir de 4 colonias recombinantes se purificó el DNA plasmídico para proceder a la secuenciación del fragmento clonado y confirmar la ausencia de mutaciones. Se seleccionó así un clon, al que se denominó pSAT.

5.3.3.2Mutagénesis dirigida de la serina catalítica de Sat.

Con la finalidad de analizar la implicación de la actividad proteasa de Sat en los efectos mediados por esta proteína nos planteamos la construcción de una variante de esta proteasa catalíticamente inactiva.

Todas las proteínas con actividad serin proteasa poseen un sitio o centro activo formado por tres aminoácidos absolutamente conservados: serina, histidina y aspartato, conjunto que recibe el nombre de tríada catalítica. La serina catalítica está contenida en el motivo GDSGS conservado en las proteínas de la familia SPATE. El centro catalítico de Sat contiene dos serinas en posiciones 256 y 258. Estudios previos dirigidos a evaluar la actividad de Sat de cepas de E. coli enteropatógenas habían introducido mutaciones en las posiciones señaladas. La mutación en la serina 256 (S256I) inhibía completamente la actividad proteasa de Sat sobre sustratos específicos como fodrina y factor V de la coagulación, mientras que una mutación en la posición 258 (S258A) produjo una disminución de la actividad hasta un 60% (Maroncle et al., 2006). Por esta razón nos propusimos mutar la serina 256 del gen sat de la cepa EcN.

La mutagénesis dirigida de la serina catalítica de Sat (S256) se realizó según el proprocedimiento descrito en Métodos 4.1.6.3. Para ello se utilizaron primers

complementarios que contenían un cambio en el codón de la serina de manera que el nuevo codón especificaba isoleucina (S256I) (Figura 5.17). El producto de la amplificación (8778 pb) a partir del plásmido recombinante pSAT fue incubado con la endonucleasa DpnI que es específica para DNA metilado y hemimetilado. Esta enzima es capaz de reconocer el DNA parental molde y digerirlo dejando sólo el DNA recién amplificado que contiene la mutación introducida (Figura 5.17). Después de realizar la transformación en células XL1-Blue, los plásmidos recombinantes fueron seleccionados en placas de LB-ampicilina. Cuatro colonias fueron seleccionadas, se obtuvo el DNA plasmídico y la correcta incorporación de la mutación fue comprobada mediante secuenciación. Se descartó así también la posible incorporación de otras mutaciones en el DNA durante el proceso de amplificación del fragmento por PCR. Se seleccionó de esta manera el plásmido recombinante pSAT (S256I).

127 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Toloza L., Tesis doctoral

Figura 5.17. Secuencia nucleótidica de la región que contiene el codón de la serina catalítica (S256) de

la proteína Sat codificada en el genoma de la cepa EcN. Debajo de esta secuencia se indican los primers

utilizados en la mutagénesis dirigida del gen clonado en pSAT para cambiar este codón por un triplete que determina Isoleucina.

5.3.3.3Construcción de un mutante EcN knockout del gen sat.

La construcción de una cepa mutante deficiente en Sat, se construyó con la finalidad de estudiar como la deficiencia en Sat afectaba al comportamiento de la cepa probiótica EcN.

Para la construcción del mutante knockout de sat se utilizó la metodología de disrupción génica mediante introducción de un cassette de resistencia a cloramfenicol (Cm) (Métodos 4.1.6.2). Brevemente, la región del gen sat que codifica el dominio secretado (3 kb) fue amplificada por PCR y clonada en el plásmido pUC18Not utilizando las dianas EcoRI y BamHI. Por otra parte el gen que confiere resistencia a cloramfenicol (cassette Cm) fue obtenido a partir del plásmido pCAT19 mediante digestión con SmaI (enzima que deja extremos romos). Este fragmento fue purificado y clonado en la diana SwaI interna al gen sat clonado en pUC18Not, produciendo así la disrupción del marco de lectura del gen sat. El gen sat mutado por inserción fue obtenido partir de este plásmido recombinante mediante digestión con NotI y subclonado en el plásmido suicida pUT-miniTn5 Tc. Este plásmido fue introducido en la cepa E.coli S17pir, y posteriormente mediante conjugación transferido a la cepa EcN rifampicinaR, donde tras recombinación homóloga se seleccionó el mutante knockout EcNsat::cm. Después de la purificación de los transconjugantes, la correcta construcción del mutante

knockout fue confirmada mediante PCR con primers que flanquean el gen sat y primers específicos del cassette Cm.