ENSAYOS in vitro.

4.2.1 Suspensión de conidios de Botrytis cinerea

Para este ensayo la suspensión del hongo se preparó a partir de un subcultivo proveniente de viales conservados de Botrytis cinerea cepa Bo004, realizado en cajas de Petri con agar PDA (Anexo 1) incubadas a 26°C +/- 2°C en oscuridad durante 10-14 días, con períodos de exposición a luz blanca para inducir esporulación.

Después del tiempo de incubación, se hizo una suspensión del hongo en una solución de agua estéril con Tween 80 0.1%, para ser aplicada (25 µl) sobre segmentos de tallos de tomate, de diferentes edades, de 4 cm de longitud, dispuestos sobre un cubo de icopor en condiciones de cámara húmeda (Moreno 2003), para reactivar la cepa. Luego de la infección y la esporulación en los tallos, se hicieron pases del hongo, a cajas de Petri con PDA y se incubaron durante 10 días a 26°C +/- 2°C en oscuridad.

La suspensión de conidios de B. cinerea reactivado para este ensayo se preparó, adicionando 20 ml de una solución de agua estéril y Extracto de Malta al 0.1% sobre el hongo crecido en caja de Petri, empleando un asa se removió el hongo, y se filtró a través de una tela de muselina estéril, para obtener los conidios. La suspensión se ajustó a una concentración de 5x105 conidios/ml, por adición de Extracto de Malta al 0.1%.

De esta suspensión de B. cinerea se inocularon 100 µl en microplacas de 96 pozos (Corning®_{, Corning Glass Works) con 100 µl de los extractos fúngicos extracelulares} (EFE) producidos en cada medio de cultivo (4.1.1), siguiendo el protocolo reportado por varios autores que han trabajado con Botrytis cinerea o con otros hongos filamentosos dispuestos para su evaluación en placas de microtitulación (Hadacek y Greger, 2000; López-García et al., 2002; Slawecki et al., 2002; Thines et al., 2004, Wilson et al.,1997).

4.2.2 Lectura de las Placas.

Los tratamientos incluidos correspondieron a los diferentes extractos fúngicos extracelulares (EFE) en combinación con 5 x 105 conidios/ml de B. cinerea y los siguientes controles: (a) suspensión de 5 x 105 conidios del patógeno en extracto de malta 0.1% sin el extracto (control negativo), (b) extractos EFE más la solución blanco sin la suspensión de B. cinerea y (c) solución blanco (extracto de malta al 0.1%), con cuatro repeticiones por tratamiento.

Las placas de microtitulación se llevaron a un agitador orbital para su incubación a 26°C +/- 1°C con agitación de 100 r.p.m, en oscuridad, durante 16 horas.

Para la lectura de absorbancia previamente se probaron cuatro diferentes longitudes de onda (405 nm, 450nm, 492nm, 620 nm) en el lector de placas de ELISA ASYS® Hitech Expert 96, con el fin de seleccionar aquella longitud que presentara mayor sensibilidad, después de obtener el delta de diferencias de los datos de densidad óptica. En este ensayo se empleó una suspensión de conidios de Botrytis cinerea preparada como se mencionó anteriormente en el numeral 4.2.1.

4.2.2.1 Curva de Calibración para Botrytis cinerea.

Con el fin de correlacionar las dos metodologías seleccionadas para la evaluación in vitro (absorbancia y germinación), en primera instancia se realizó una curva de calibración, que sirvió para relacionar la germinación de los conidios del patógeno con valores de absorbancia a la longitud de onda seleccionada anteriormente (405 nm). Por tanto, se prepararon varias concentraciones de B. cinerea dentro del rango de 1x105 hasta 1x106 conidios/ml, mediante diluciones con una solución de extracto de malta al 0.1% hasta llegar a un volumen final de 200µl en cada pozo una placa de microtitulación (Corning®, Corning Glass Works), con cuatro repeticiones para cada una de las concentraciones. Como blanco, se empleó la solución de extracto de malta al 0.1%. Posteriormente, las placas se llevaron a un lector de placas de ELISA ASYS® Hitech Expert 96 para evaluar la densidad óptica en el tiempo cero con una longitud de onda establecida.

4.2.2.2 Actividad Antifúngica de los Extractos (EFE).

De cada uno de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos (dos por cepa) se evaluó una concentración de 50% v/v (Slawecki et al., 2002). La cual se preparó en combinación con la suspensión de conidios de B. cinerea ajustada en una solución de extracto de malta al 0.1%. Para disponer por cada pozo dentro de la placa de 96 pozos (Corning®_{, Corning Glass Works) un volumen final de extracto y} conidios de 200 µl con cuatro repeticiones por extracto. Al tiempo cero se realizó la lectura de densidad óptica (λ=405nm) en el lector de ELISA ASYS® Hitech Expert 96. Después de 16 horas en incubación y agitación de las microplacas, se realizaron tanto las lecturas de absorbancia en el lector de ELISA ASYS® Hitech Expert 96 como las observaciones directas en microscopio con un objetivo de 40X para cuantificar la inhibición de la germinación de conidios del hongo B. cinerea.

La metodología fue la siguiente; se seleccionó aleatoriamente un pozo por tratamiento y se dispensó dentro del pozo 10 µl de azul de lactofenol, para aumentar el contraste visual de las estructuras del hongo. Se tomaron 20 µl que se colocaron sobre una lámina portaobjetos para capturar las imágenes de la germinación con

una cámara digital. Posteriormente, se eligieron campos al azar con mínimo 10 conidios por campo y se estimó a las 16 horas de incubación, el porcentaje de germinación (sumando el No. de conidios germinados y dividiendo entre el No. total de conidios germinados y no germinados), al promediar cada uno de los campos seleccionados por tratamiento.

Para calcular el porcentaje de inhibición de la germinación de B. cinerea en cada uno de los tratamientos (EFE) se empleó la fórmula:

% Inhibición (I) = (100 - %GEFE) – (100 - % GBo) donde:

%GEFE = porcentaje de germinación de B. cinerea en presencia del EFE.

% GBo = porcentaje de germinación de B. cinerea en ausencia del EFE (Díaz, 2006).

4.2.3 Análisis Estadístico.

Los extractos fúngicos extracelulares (EFE) dependiendo de los medios líquidos de producción (Czapeck-Dox y YMG) de donde provenían, se agruparon de acuerdo al porcentaje de inhibición (I) de la germinación, constituyendo 3 grupos de inhibición (1: baja; 2: media; 3: alta) mediante el análisis de agrupamiento con el método de vínculos unitarios nearest neighbor y la distancia métrica del cuadrado euclidiano squared euclidean del programa STATGRAPHICS versión 4.2. Se seleccionó de cada bloque de medio de producción, los extractos del grupo de inhibición alta que fueron probados en los ensayos in planta.

Para la correlación de las dos metodologías, porcentaje de germinación de B. cinerea y densidad óptica (λ=405nm), empleadas en la técnica in vitro, en

primera instancia se calculó el delta (∆) de densidad óptica a las hora 16 en cada tratamiento EFE después de promediar las repeticiones (4) y corregir con los valores de densidad óptica de los controles extracto EFE más solución blanco y suspensión de B. cinerea en extracto de malta 0.1%, en el tiempo cero. Para comparar el

porcentaje de germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica se retiraron los extractos con DO superiores a 0.9 a la hora 0 y coeficientes de variación superiores al 10% de la DO de la hora 0 respecto de la hora 16 para los controles de los extractos sin el inóculo del patógeno. Se aplicó un modelo de calibración usando el programa STATGRAPHICS 4.2.

4.3 ENSAYOS in planta.