Ensayos de unión a hemo por la proteína Tc HTE

Para comprobar si TcHTE es capaz de unir hemo, se realizaron ensayos de cromatografía de afinidad utilizando resina de hemin-agarosa (hemina conjugada a agarosa, SIGMA-ALDRICHR) similares a los realizados para estudiar la unión a hemo por la proteína LABCG5 [Campos-Salinas, et al., 2011]. Se diseñaron ensayos de competencia donde las muestras fueron tratadas con concentraciones crecientes de hemina (de 0 a 100 μM) previo a su incubación con la resina de hemin-agarosa. De este modo, se esperaba recuperar mayor cantidad de proteína TcHTE en los eluidos de las muestras tratadas con la menor cantidad de hemina y se recuperaría menor cantidad de TcHTE en los eluidos de las incubadas con mayor cantidad de hemina. Para ello, primero fue necesario establecer las condiciones para la obtención de la proteína TcHTE en la fracción soluble, manteniendo su estructura nativa, a partir de extractos celulares totales de epimastigotes crecidos en medio LIT-10% SFB con 5 μM hemina. Ensayamos diferentes condiciones de lisis suave con una solución (50mM Tris pH 7,5, 500mM NaCl, 10% (v/v) Glicerol) que contuviera una concentración adecuada de los detergentes Tritón X-100, duodecil maltócido (DDM) o digitonina, disponibles en el laboratorio y como se describe en la sección IV.6.9 de Materiales y Métodos. También se utilizaron como control la misma solución con el agregado de SDS y la solución de lisis que contiene 8 M urea, que fuera empleada para la obtención de extractos en los demás ensayos similares (sección IV.6 de Materiales y Métodos). La presencia de TcHTE fue analizada por ensayos de Western blot, utilizando los anticuerpos anti-P1TcHTE, tanto en la fracción insoluble (pellet) como en la soluble (sobrenadante). En la Figura 61 se muestran los resultados obtenidos donde puede observarse la presencia de TcHTE en todos los pellets, excepto en

V- Resultados

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Figura 61. Solubiladad de la proteína TcHTE utilizando diversos detergentes. Ensayo de Western blot utilizando suero inmune anti-P1TcHTE para el reconocimiento de la proteína TcHTE en extractos proteicos totales de epimastigotes de T. cruzi tratados con diferentes detergentes. P: pellet S: sobrenadante. 1: 0,1% Tritón X-100. 2: 1% Duodecil maltócido 3: 2% Digitonina. 4: 5% SDS. 5: 5% SDS + 9 M Urea. 6: 8 M Urea.

el control utilizando la solución que contiene 8 M de Urea y con diferente intensidad en las fracciones solubles. La señal má intensa correspondiente a TcHTE en las fracciones solubles correspondió a la muestra tratada con digitonina, por lo que fue el detergente elegido para la preparación de los extractos para evaluar la unión de TcHTE a la resina de hemin-agarosa.

Una vez establecidas estas condiciones, se prepararon extractos proteicos totales de epimastigotes crecidos en medio LIT-10% SFB con 5 μM hemina en la solución de lisis (50mM Tris pH 7,5, 500mM NaCl, 10% Glicerol) con 2% p/v digitonina. Posteriormente, se recuperó la fracción soluble, se la incubó con concentraciones crecientes de hemina (0, 5, 20, 50, 100 μM) por 30 min, y luego se realizó la incubación con la resina de hemin- agarosa ON en agitación suave a 4 °C. Seguidamente las muestras fueron tratadas para su análisis por ensayos de Western blot (sección IV.6.8 de Materiales y Métodos) que se muestran en la Figura 62. Sorprendentemente, los resultados obtenidos fueron opuestos a lo esperado. Las señales correspondientes a TcHTE fueron más intensas en aquellas muestras que fueron previamente incubadas con mayor concentración de hemina y además se observaron bandas de mayor tamaño al esperado. Considerando que la proteína TcHTE tiene un tamaño teórico de 18,8 KDa, las bandas de mayor tamaño podrían corresponder a la formación de dímeros o trímeros de la proteína, así como a su asociación a otras proteínas que formen parte del complejo responsable del transporte de hemo. También se analizó mediante ensayos de Western blot la presencia de tubulina en los eluidos de la resina con anticuerpos anti-α tubulina (clon TAT-1) como se detalló en todos los casos anteriores. Contrariamente a lo esperado, se observó una señal intensa correspondiente a la detección de tubulina en todos los eluidos (no mostrado). Estos resultados nos llevaron a pensar que la unión de las proteínas a la resina hemin-agarosa

P S P S P S P S P S P S

1

2

3

4

5

6

TcHTE (18,8 KDa)

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Figura 62. Ensayos de union de la proteína TcHTE mediante cromatografía de afinidad utilizando resina de hemina-agarosa. Ensayo de Western blot utilizando suero inmune anti-P1TcHTE para el reconocimiento de la proteína TcHTE en los eluidos de la purificación mediante columna de afinidad con resina de hemina-agarosa de extractos proteicos de epimastigotes de T. cruzi. Los extractos fueron previamente incubados con diferentes cantidades de hemina por 30 min. Calle 1: extracto total sin purificar. Calle 2: 0 μM hemina. Calle3: 5 μM hemina. Calle 4: 20 μM hemina. Calle 5: 50 μM hemina. Calle 6: 100 μM hemina.

podría no ser una unión específica debido al reconocimiento del hemo por los sitios de unión de TcHTE, sino a una unión inespecífica. Para corroborar esta posibilidad, se planteó realizar otros controles como el tratamiento de las muestras con una resina de agarosa, previo a la incubación con la resina de hemin-agarosa con el fin de eliminar inespecificidades de unión. Sin embrago, por razones de tiempo, dichos controles no pudieron ser realizados al momento de escritura de esta Tesis. No obstante, los resultados obtenidos mediante estos ensayos sugieren la posibilidad de que TcHTE se encuentre formando multímeros, que podrían ser estabilizados por la presencia de hemina.