En general, es ampliamente aceptado que diferencias en la acumulación de ARNm está directamente asociado a una diferencia en la concentración de proteína y de su actividad, sin embargo, esta relación puede no ser lineal. Es por ello que, contando con la posibilidad de poder estimar la cantidad relativa de TcHTE mediante ensayos de Western blot, nos propusimos evaluar si la diferencia observada a nivel de transcripto también se reflejaba directamente en la cantidad de proteína detectada. Para ello realizamos ensayos de Western blot utilizando los anticuerpos anti-P1TcHTE, sobre extractos proteicos totales de los diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Además, se evaluó la presencia de tubulina con anticuerpos específicos (anti-α tubulina clon TAT-1) como control de carga. Se procesó de igual manera una muestra de células Vero, la cual fue utilizada como control de que las señales obtenidas provinieron de los parásitos y no de las células Vero utilizadas para la obtención de los tripomastigotes y amastigotes. En la Figura 55, se muestran los resultados de un ensayo de Western blot, donde puede observarse que fue posible detectar la presencia de TcHTE en el estadio de amastigote.
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V- Resultados
140
Figura 55. La acumulación de la proteína TcHTE varía entre los diferentes estadios del ciclo de vida de Trypanosomacruzi. Ensayo de Western blot utilizando suero inmune anti-P1TcHTE para el reconocimiento de la proteína de endógena TcHTE en extractos proteicos totales de céluas Vero (V), tripomastigotes (T), amastigotes (A) y epimastigotes (E). Se utilizó anticuerpos anti-α tubulina (clon TAT-1) para el reconocimiento de tubulina como control de carga de los extractos totales.
Así mismo no se observó la señal correspondiente a TcHTE en la calle control que contenía extractos proteicos totales de células Vero, indicando que la señal observada efectivamente proviene de la forma intracelular del parásito. También se observó una señal de menor intensidad en la calle que contiene extracto total de tripomastigotes. Por otro lado, no pudimos detectar la presencia de la proteína TcHTE en los extractos totales de epimastigotes. Estos resultados llamaron nuestra atención, ya que en el estadio de tripomasitogte se detectó la menor concentración del transcripto, sinedo además, el estadio donde no pudo detectarse la incorporación de los diferentes AHs. Asimismo en el estadio de epimastigotes se detectó la mayor concentración de transcripto y, además, es uno de los estadios donde previamente se detectó el transporte de los diferentes AHs. Una posible causa que explicaría la no detección de TcHTE en epimastigotes radicó en que esa muestra correspondía a epimastigotes que habían sido crecidos en medio LIT-10% SFB suplementado con 20 μM hemina, cantidad de hemina que podría ser suficiente para reducir los niveles de expresión del gen, o los niveles de acumulación de la proteína. En cuanto a la señal detectada en la muestra de tripomastiotes, la misma podría atribuirse a la presencia de amastigotes contaminantes en el sobrenadante celular al momento de la toma de la muestra de tripomastigotes. Para corroborar esta hipótesis, decidimos repetir los ensayos de Western blot, utilizando extractos proteicos totales de epimastigotes crecidos en LIT-10% SFB 5 μM hemina, que luego fueron incubados por 72 h en medios LIT-10% SFB suplementado con 0, 5 y 20 μM hemina. Además, para descartar una posible contaminación con amastigotes en la muestra de tripomastigotes, los extractos celulares
TcHTE (18,8 KDa) Tubulina
V
T
A
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KDa 10 15 25 35V- Resultados
141 totales se obtuvieron a partir de tripomastigotes puros verificando la ausencia de amastigotes en la muestra mediante microscopía óptica al momento de la toma de muestra. En la Figura 56 se muestran los resultados de este ensayo, donde pudo detectarse la señal correspondiente a TcHTE en los extractos proteicos totales de amastigotes. También se detectó la señal correspondiente a TcHTE en la muestra de tripomastigotes, aunque en este caso la banda fue de menor intensidad. Además, se observó un cambio importante en la intensidad de la señal de la proteína TcHTE en los extractos provenientes de epimastigotes incubados 72 h en los medios con diferente disponibilidad de hemina. La señal más intensa correspondió a la muestra de los epimastigotes mantenidos en ausencia de hemina (0 μM). La señal obtenida de los epimastigotes incubados con 5 μM hemina fue de menor intensidad, y la detectada en la muestra proveniente de epimastigotes incubados con 20 μM hemina fue más débil aún. Estos resultados indican claramente que la acumulación de la proteína TcHTE disminuye considerablemente con el aumento de la concentración de hemina en el medio de cultivo. La diferencia observada en los niveles de acumulación de TcHTE en las ditintas muestras de epimastigotes incubados con 20 μM hemina que se muestra en la figura 55 (sin detección) y en la figura 56 (señal definida) podría atribuirse al tiempo de incubación de los epimastigotes en esas condiciones, ya que en el primer caso, la incubación fue de siete días, y en el segundo de sólo dos días.
Figura 56. La acumulación de la proteína TcHTE en epimastigotes es afectada por la concentración de hemina disponible en el medio de cultivo. Ensayo de Western blot utilizando suero inmune anti-P1TcHTE para el reconocimiento de la proteína de endógena TcHTE en extractos proteicos totales de amastigotes (A), tripomastigotes (T), y epimastigotes (E), incubados en medio LIT-10% SFB suplementado con 0, 5 y 20 μM hemina por 48 horas. Se utilizó anticuerpos anti-α tubulina (clon TAT-1) para el reconocimiento de tubulina como control de carga de los extractos totales. TcHTE (18,8 KDa) Tubulina
A
T
KDa 1015 25 35E
0
5
20
[Hemina] μM
V- Resultados
142 Los resultados expuestos en esta sección indican que la acumulación de la proteína TcHTE depende del estadio del ciclo de vida del parásito siendo mayor en los estadios replicativos (epimastigotes y amastigotes) donde se verificó el tra nsporte de hemo en el paráito. Además, en epimastigotes, la acumulación de TcHTE respondió a la disponibilidad de hemina en el medio de cultivo.
V.4.2.3 Efectos de la disponibilidad de hemo (AHs) sobre la
transcripción y acumulación de
TcHTE en epimastigotes de
Trypanosoma cruzi
Con el fin de profundizar los conocimientos sobre la relación entre la proteína
TcHTE y el hemo en T. cruzi, nos propusimos evaluar como las variaciones en la disponibilidad de hemina en el medio de cultivo afectan tanto los niveles de transcripto como de acumulación de la proteína TcHTE en epimastigotes. Los resultados obtenidos se muestran y discuten en los siguientes apartados .