Epidemiologia molecular

La epidemiología en microbiología se enriqueció con la utilización de técnicas de biología molecular, orientadas a la tipificación de los microorganismos en base a sus características genéticas. A esta rama de la microbiología se la denomina epidemiología molecular y contempla estudios con distintos enfoques. Entre ellos destacan la identificación de la distribución de los microorganismos, la vigilancia epidemiológica de las enfermedades infecciosas y la evolución.

La genotipificación de aislamientos de M. tuberculosis y M. bovis ha sido ampliamente utilizada en investigaciones ante brotes epidémicos, como herramienta en estudios de transmisión dinámica y otros aspectos de la epidemiología de la tuberculosis. Mediante estudios poblacionales, es posible vigilar el curso de las campañas de control, pudiendo detectar los cambios en la heterogeneidad de los patrones de los aislamientos estudiados (Cataldi y col., 2002).

Entre las técnicas mas aplicadas se encuentra el polimorfismo en longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism). Como sonda se usa la secuencia de inserción IS6110. La variabilidad en el número de copias de IS6110 observado en aislamientos clínicos, junto con la supuesta naturaleza de transposición al azar,

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condujeron a un método de tipificación estandarizado para estudios epidemiológicos, que se convirtió en el más utilizado para el complejo M. tuberculosis (Warren y col., 2000). La epidemiología molecular de la tuberculosis humana se encuentra muy avanzada por los estudios de polimorfismo por RFLP-IS6110. Sin embargo, la utilidad de IS6110 es menor en aquellas cepas que en su genoma poseen una o muy pocas copias de este elemento, como en los aislamientos M. bovis provenientes de bovinos (Cousins y col., 1998). Una desventaja es que requiere gran cantidad de ADN purificado y que demora varias semanas debido al cultivo previo. Sin embargo, Liebana y col. (1997) demostraron que mas del 50% de los aislamientos de bovinos en España presentaban múltiples copias. De este modo, debido a la necesidad de suplir las dificultades principales del RFLP, se desarrollaron otros métodos basados en PCR.

Existen dos técnicas basadas en la biología molecular que han demostrado su eficacia en la caracterización molecular de cepas, tanto de M. bovis como de M. tuberculosis (Romano y col., 1996). Una de estas técnicas, el spoligotyping (Aranaz y col., 1996) se basa en la amplificación por PCR de la región DR, un locus único y altamente polimórfico presente en el cromosom de las micobacterias del complejo M. tuberculosis. Esta región contine múltiples secuencias repetidas de 36 pares de base (pb) separados por espacios intersecuenciales de una longitud de 35 a 41 pb. Al producto de la PCR de cada aislado individual se le permite hibridarse a 37 secuencias epaciadoras de M tuberculosis H37Rv y seis secuencias espaciadoras de M. bovis BCG P3 (Kamerbeek y col., 1997; Cataldi, 2001).

Después de la hibridación y detección pueden identificarse las secuencias espaciadoras que son comunes al aislado y el conjunto de los oligonucleotidos espaciadores. Con esta técnica puede establecerse no solo la presencia del agente, sino diferenciar la especie y la cepa, como se ha utilizado en varias zonas geográficas; entre otras en México (Perez Guerrero y col., 2008), en Sur América (Zumarraga y col., 1999) e Inglaterra (Smith y col., 2003).

Figura 1: DVR spoligotyping de las bacterias M. tuberculosis y M. bovis. La presencia o ausencia de

“espaciadores” de secuencia conocida definen patrones de hibridación o “spoligotipos”, que se caracterizan por la composición de cuadrados negros.

La imagen (Figura 1) corresponde a un film obtenido en el laboratorio del Instituto de Biotecnología del CICVyA, INTA Castelar (Cataldi, 2001). Se indican los spoligotipos de M.

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tuberculosis H37Rv, M. bovis BCG y M. bovis de aislamientos de campo. Los números en la parte superior de la figura indican el orden de ubicación de los “espaciadores” en la membrana.

En la República Argentina, se comenzó a utilizar el Spoligotyping en el año 1996, en el Instituto de Biotecnología del CICVyA, INTA Castelar, para la tipificación de aislamientos de M. bovis (Zumárraga y col., 1999).

Los VNTRs (repeticiones en tándem de número variable) constituyen fragmentos de ADN repetitivos, dispuestos en tándem, similares a las secuencias minisatélites presentes en el genoma de eucariontes. La utilización de estas secuencias en estudios de tipificación molecular se basan en la variabilidad en el número de las unidades repetitivas, siendo los eventos recombinatorios del ADN una de las causas de su variabilidad. Cada locus VNTR representa una porción diferente del genoma independiente entre sí, proporcionando múltiples caracteres independientes, de utilidad tanto en investigaciones epidemiológicas como en análisis filogenéticos (Supply y col., 2006). Los MIRUs son VNTR que consisten en secuencias repetitivas que oscilan entre 40 y 100 pb, dispuestas en tándem y distribuidas en regiones intergénicas de las micobacterias que integran el complejo Mycobacterium tuberculosis (Supply y col., 2006). El polimorfismo entre las distintas cepas analizadas se evidencia por la diferencia en tamaño del fragmento amplificado, el cual es inherente al número de unidades repetitivas por locus. En el genoma de M. tuberculosis H37Rv se identificaron 41 loci MIRU diferentes, 12 de los cuales fueron polimórficos (Supply y col., 2006). Los resultados pueden ser expresados mediante un número, en el cual cada dígito representa el número de unidades repetitivas de un locus MIRU en particular. Para el análisis a gran escala, y como una alternativa ventajosa, se pueden realizar las amplificaciones mediante PCRs múltiples, utilizando para cada locus MIRU, uno de los oligonucleótidos iniciadores marcado con un fluorocromo diferente. Los productos de PCR así obtenidos, son entonces sometidos a electroforesis en secuenciador automático y el tamaño de los fragmentos amplificados son determinados con un programa adecuado.

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