El HSQC emplea la detección inversa y es, por tanto, más sensible que los espectros detectados en C13. Existen numerosas variantes del HSQC adaptadas a la medida de acoplamientos CH tanto en la dimensión directa (F2) como en la indirecta (F1). El experimento HSQC original se debe a Bodenhausen.[77] La secuencia básica consiste en una
transferencia de polarización INEPT desde el protón al heteroátomo, un periodo de evolución t1 con un pulso de 180º en el medio y, una transferencia de retro-INEPT desde el heteroátomo
al protón (Figura 0.24).[78, 79] El primer bloque INEPT genera magnetización en antifase del
heteroátomo con respecto a1H . Durante t
1 evoluciona el desplazamiento químico de13C . El
pulso de 180º de protón en el centro de t1 reenfoca la evolución del acoplamiento1JCH. El
último pulso de 90º de13C junto al de protón transfiere la magnetización en antifase al protón,
que se convierte en magnetización en fase detectable al final del reenfoque. Pueden incluirse gradientes de campo (PFG) para mejorar la supresión de artefactos o la selección de coherencias.
Figura 0.23: Esquema de la transferencia de la magnetización del experimento HSQC. Se muestran los cuatro bloques A, B, C y D de la Figura 0.24.
Figura 0.24: Secuencia básica de pulsos del experimento HSQC. La secuencia consta de cuatro bloques: (A) INEPT, donde se produce la transferencia de la polarización del1H al13C por medio del acoplamiento 1J
CH. (B) La magnetización de13C (antifase) evoluciona durante t1 por desplazamiento químico.
Opcionalmente, el acoplamiento heteronuclear se reenfoca mediante el pulso de 180º en1H en el centro
de t1. (C) R-INEPT o INEPT inverso, donde se transfiere la magnetización del13C al1H. (D) Adquisición
en el canal de 1H con el 13C desacoplado.
Existen diferentes versiones del HSQC con patrones de correlación distintos que nos facilitan la medida de los acoplamientos. En la Figura 0.25 se muestra esquemáticamente la apariencia de un CH en un HSQC desacoplado, un HSQC acoplado en F1 y un HSQC acoplado en F2 (de izquierda a derecha).
Figura 0.25: Patrones de acoplamiento de un CH en un HSQC: desacoplado en ambas dimensiones (izquierda), acoplado en F1 (centro) y acoplado en F2 (derecha).
HSQC acoplado en F2: F2-coup HSQC
El HSQC acoplado en la dimensión directa (F2-coup HSQC) permite extraer de forma directa el valor de la constante de acoplamiento (Figura 0.26). La diferencia con el HSQC original es que se ha desactivado el desacoplador de protón durante la adquisición (Figura 0.28). Una ventaja del F2-coup HSQC es que se puede adquirir con elevada resolución digital en la dimensión directa, ya que el desacoplador está apagado. Uno de sus principales inconvenientes es la distorsión de fase debida a la magnetización en antifase heteronuclear, causada por la gran desviación de la constante de acoplamiento efectiva de las experimentales en las muestras anisótropas. Se han propuesto una serie de modificaciones para minimizar la
distorsión en antifase, como el CLIP F2-coup HSQC (CLIP, CLean In-Phase) que suprime la magnetización heteronuclear en antifase aplicando un pulso de 90º justo antes de la detección en 13C (Figura 0.28).[79]
Figura 0.26: Espectro acoplado F2-coup HSQC (zona alifática) de fenilmentolquinolina en medio orientado PDMS/CDCl3. Los acoplamientos 1DCH producen desdoblamiento en la dimensión de protón.
Figura 0.27: Expansiones del espectro F2-coup HSQC de la fenilmentolquinolina (muestra orientada en PDMS/CDCl3). Izquierda: Expansión del metilo C33. Derecha:
Expansión del metino CH-2.
Otro inconveniente del espectro F2-coup HSQC es la superposición de los acoplamientos dipolaresnD
HH con los acoplamientos1DCH. Esto puede complicar e incluso impedir la
extracción de los acoplamientos 1D
CH debido a la complejidad y anchura de los multipletes.
Este problema se evita midiendo los acoplamientos en la dimensión indirecta con experimentos F1-coup HSQC. Aunque la resolución digital en F1 no puede alcanzar los valores de F2, en las condiciones apropiadas es posible obtener valores más exactos del acoplamiento T debido a la ausencia de acoplamientos HH. Finalmente, se han propuesto experimentos de tipo IPAP para resolver el frecuente solapamiento de las señales de los metilenos (donde los dos protones aparecen a la misma frecuencia de carbono en F1).[80]
Figura 0.28: Secuencia de pulsos del experimento F2-coup HSQC. Nótese la ausencia de desacoplador durante la detección. Los pulsos de13C pueden ser tanto adiabáticos como
pulsos duros. Periodo τ = 1/(4J), El intervalo de evolución del INEPT τ se ajusta generalmente para J = 145 Hz; δ = 1/(8J), selección de multiplicidad. Ciclado de fases: ϕ1 = x, –x; ϕ2 = x, x, –x,
–x; ϕ3 = x, x, –x, –x; ϕrec = x, –x,–x, x. Intensidad de gradientes (% de potencia máxima): G1=
80, G2 = 20.
Figura 0.29: Secuencia de pulsos del experimento F2-coup-HSQC CLIP. Los pulsos de13C pueden ser
tanto adiabáticos como pulsos duros.τ = 1/(4 (J + D)). El intervalo de evolución del INEPT se ajusta generalmente para (J + D) = 130 – 160 Hz; δ = 1/(8J), selección de multiplicidad. Ciclado de fases: ϕ1 = x, –x; ϕ2 = x,x,x,x, –x, –x, –x, –x; ϕ3 = x, x, –x, –x; ϕ4 = x, –x; ϕrec = –x, x,x, –x.
Intensidad de gradientes (% de potencia máxima): G1 = 80, G2 = 20.
HSQC acoplado en F1: F1-coup HSQC
El HSQC acoplado en F1 (F1-coup HSQC)[81] muestra el desdoblamiento de las señales en la
dimensión del 13C (Figura 0.30). Cuando se elimina el pulso de 180º del canal de 1H que hay
en el centro del período de la evolución t1 de la Figura 0.24 se evita el problema de
acoplamiento 1H-1H , que no interfieren en la medida de los acoplamientos1J
CH/ 1DCH en la
dimensión indirecta (Figura 0.32). Este experimento presenta, no obstante, una serie de inconvenientes. Son experimentos que requieren tiempos de medida más elevados para alcanzar una resolución digital suficiente y, con todo, se alcanzan valores menores que en los F2-coup HSQC. Durante t1 ademas de evolucionar 1JCH, también lo hacen los acoplamientos 1H
–13C de largo alcance (nJ
CH, n > 5), provocando un ensanchamiento adicional (o incluso un
desdoblamiento) de las señales en F1 debido anD
CH. Estos acoplamientos suponen una fuente
de error en la medida de los acoplamientos a un enlace. Se reducen o eliminan con la incorporación del bloque BIRD[82] en la secuencia HSQC acoplado en F1 (Figura 0.33).
Figura 0.30: Espectro acoplado F1-coup HSQC (zona alifática) de la fenilmentolquinolina en medio orientado PDMS/CDCl3. Los acoplamientos 1DCH producen desdoblamiento en la dimensión indirecta.
Figura 0.31 Expansiones del espectro F1-coup HSQC de la fenilmentolquinolina (medio orientado PDMS/CDCl3). Izquierda: Expansión del metilo C32. Derecha: Expansión del
CH-2.
El experimento F1-coup HSQC permite multiplicar el desdoblamiento en F1 por un factor κ de escalado del acoplamiento (J-scaling). Esto resulta en un aumento de la resolución efectiva sin necesidad de alargar en exceso el número de incrementos de t1. Factores típicos son κ = 3
o 4.[81] También se han adaptado el escalado de J y filtro BIRD a un espectro 3D.[83]
Figura 0.32: Secuencia de pulsos del experimento F1-coup HSQC básico.Los pulsos de13C pueden
ser tanto adiabáticos como pulsos duros. Periodo τ = 1/(4J), El intervalo de evolución del INEPT τ se ajusta generalmente para J = 145 Hz; δ = 1/(8J), selección de multiplicidad. Ciclado de fases: ϕ1 = x, –x; ϕ2 = x, x, –x, –x; ϕ3 = x, x, –x, –x; ϕrec = x, –x,–x, x. Intensidad de gradientes (%
Figura 0.33: Secuencia de pulsos del experimento J-scaled HSQC BIRD, con escalado de J.Los pulsos d e13C pueden ser tanto adiabáticos como pulsos duros. Periodo τ = 1/(4J) . El intervalo de
evolución del INEPT τ se ajusta generalmente para J = 145 Hz. K, factor de multiplicación de la evolución de J. EL intervalo del BIRD se ajusta a 1/(2J); δ = 1/(8J), selección de multiplicidad. Ciclado de fases: ϕ1 = y; ϕ2 = x, –x; ϕ3 = x, x, –x, –x; ϕ4 = x, x, x,x,–x, –x,–x,–x; ϕrec = x,–x,x,–x–
x,x,–x,x. Intensidad de gradientes (% de potencia máxima): G1 = 80, G2 = 20.
Los acoplamientos C-H de protones no equivalentes en metilenos pueden extraerse por separado, en principio, en los espectros de F1-coup HSQC. El C del metileno da en principio un doblete de dobletes por acoplamiento con sus protones H1 y H2 (valores = T1 y T2, en Hz). El mismo desdoblamiento debe verse a las frecuencias de protón de H1 y H2. Hay una diferencia entre ambos multipletes, ya que la J activa aparece en fase y la pasiva en antifase (Figura 0.35, centro). No obstante, si los valores de T1 y T2 son bastante diferentes, las resonancias interiores del multiplete aparecen resueltas. Pero si los valores son próximos, se cancelan parcial o totalmente, dificultando la extracción de los valores individuales de los acoplamientos (Figura 0.34). En estos casos es preferiblemente medir la suma de los dos acoplamientos como la distancia entre las resonancias exteriores del multiplete; para los cálculos su usan los valores del acoplamiento promediados como semisuma, como se describe en el Capítulo 1.
Figura 0.34: Ejemplo de multiplete de un metileno en un espectro F1-coup HSQC de la fenilmentolquinolina (medio orientado PDMS/CDCl3). La señal
corresponde al metileno C6. Las señales en antifase del centro no se cancelan y permiten apreciar los acoplamientos T activo y T pasivo.
Figura 0.35: Esquema que muestra las señales del acoplamiento en un F1-
coup-HSQC para: (A) un grupo CH; (B) un grupo CH2; y (C) un grupo CH3. El
sombreado de los picos indica el signo: negro, positivo; blanco, negativo. Los multipletes de metinos (CH) y metilos (CH3) están en fase; en los metilenos,
un doblete está en fase (J activa) y el otro en antifase (J pasiva).