Constantes de acoplamiento en la determinación estructural de compuestos orgánicos y biopolímeros. Software y experimentación

CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO

EN LA DETERMINACIÓN

ESTRUCTURAL DE COMPUESTOS

ORGÁNICOS Y BIOPOLÍMEROS.

SOFTWARE Y EXPERIMENTACIÓN

Raquel Santamaría Fernández

Departamento de Química Orgánica

Centro singular de investigación en química biológica y

materiales moleculares (CIQUS)

SANTIAGO DE COMPOSTELA

2015

CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO

EN LA DETERMINACIÓN

ESTRUCTURAL DE COMPUESTOS

ORGÁNICOS Y BIOPOLÍMEROS.

SOFTWARE Y EXPERIMENTACIÓN

Raquel Santamaría Fernández

Departamento de Química Orgánica

Centro singular de investigación en química biológica y

materiales moleculares (CIQUS)

SANTIAGO DE COMPOSTELA

2015

Pernambuco, D. Víctor M. Sánchez Pedregal, Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela, y D. Francisco Javier Sardina López, Catedrático del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela,

INFORMAN:

que el trabajo de Tesis Doctoral titulado “CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO EN LA DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL DE COMPUESTOS ORGÁNICOS Y BIOPOLÍMEROS. SOFTWARE Y EXPERIMENTACIÓN", que presenta Dª Raquel Santamaría Fernández, para optar al grado de Doctora en Química Orgánica, ha sido realizado en este departamento bajo nuestra dirección y, considerando que se ha concluido, autorizan su presentación para que pueda ser evaluada por el tribunal correspondiente.

Y para que así conste, firman el presente informe:

Fdo.: Francisco Javier Sardina López Fdo.: Víctor M. Sánchez Pedregal

Fdo.: Armando Navarro Vázquez Fdo.: Raquel Santamaría Fernández

Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela bajo la dirección de los doctores D. Armando Navarro Vázquez, D. Víctor M. Sánchez Pedregal y D. Francisco Javier Sardina López

Dª Raquel Santamaría Fernández ha sido contratada con fondos a cargo del proyecto

PGIDIT07PXIB209025PR d e lprograma xeral de investigación de la Xunta de Galicia desde 2/6/2008 al 10/8/2009, y a cargo del proyectoPET2008_0274 del Plan Nacional de I+D+i del Ministerio de Ciencia e Innovación desde el 11/9/2009 al 31/12/2009.

Tengo que agradecer mucho y a mucha gente que de alguna u otra forma han estado y están a mi lado.

Al prof. Javier Sardina López, al prof. Víctor M. Sánchez Pedregal y al Dr. Armando Navarro Vázquez, mis directores de tesis, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio, por todo lo que he aprendido, por su paciencia y por su inestimable ayuda.

Al Dr. Roberto R. Gil, que hizo que mi estancia en Pittsburgh fuera estupenda, por enseñarme tanto, por ayudarme y animarme en todo momento y sobre todo por esos momentos tan geniales de risas.

Al Dr. Javier Benavente y a los compañeros de dicho laboratorio, porque aunque no hubo buenos resultados aprendí mucha bioquímica y porque tener compañeros de laboratorio le da un color especial.

Mi más sentido agradecimiento a mis padres y a Carolina, que me han dado todo en todos los sentidos de forma incondicional, y porque le dan sentido a todo lo que hago.

Quiero agradecer de forma muy especial a Kike que tanto me apoya, por sus constantes ánimos, por centrarme cuando me pierdo y por ser como es conmigo. No quiero dejarme atrás a la familia Alvear-Arroyo, a Jorge, Fabiola, Micaela, Julia y por supuesto, a Enriqueta, que me hacen sentir uno mas a su lado, por sus palabras de ánimo, de esperanza y por su tremenda ayuda sobre todo en esos días en los que ves todo negro.

También tengo mucho que agradecer a esas personas con quienes tantos y tan buenos momentos he pasado, antes y durante este viaje, y que sin ellos no existiría este momento, a Rocío y Felipe, Emma, Alicia, Marta, Javi, Luz, Roci, Javi y Mery, Eva, Laura, Inma, Mónica, Gayathri, Roberto y Gloria, Juan, Verónica, Alberto y Pili, Alberto y Patricia, Gemma, Ángel y Alcira, Ángel, Unai, Leire y a Kaos.

DE COMPUESTOS ORGÁNICOS Y BIOPOLÍMEROS. SOFTWARE Y EXPERIMENTACIÓN

SUMMARY

This thesis describes the development and application of new methodologies for the structural analysis of conformationally flexible molecules by using NMR in aligned media.

The use of Residual Dipolar couplings (RDC) is becoming a powerful methodology for the the determination of relative configuration in small organic molecules. However, nowadays its use is mostly limited to rigid or semirigid molecules. It is the purpose of this thesis to investigate, ameliorate and establish the scope and limitations of the so-called single-tensor approximation for the analysis of conformationally flexible molecules.

A modification of SVD equations has been proposed for the treatment of RDC data from methyl, phenyl and methylene groups. This modification was tested in the analysis of 8-phenylmenthol and derivatives thereof, as well as in the analysis of stannyl cyclohexenyl systems and the alkaloid retrorsine. Finally, the performance of the single-tensor approximation was evaluated in the conformational analysis of the quinine alkaloid. It was found that that is a too raw approximation for systems where conformational jumping induce large changes in the global shape and, therefore, more sophisticated approaches will be needed.

Esta tese descrebe o desenvolvimento e aplicación de novas metodoloxías focadas na análise estrutural de moléculas conformacionalmente flexíbeis mediante o uso da RMN en medios orientados.

O uso dos acoplamentos dipolares residuais (RDC) está converténdose nunha metodoloxía poderosa para a determinación da configuración relativa de moléculas orgánicas pequenas. Porén, hoxe en día o seu uso está limitado a moléculas ríxidas ou semiríxidas. É o propósito desta tese investigar, melhorar e establecer os limites da aproximación de tensor único para a análise de moléculas conformacionalmente flexíbeis.

Propuxemos unha modificación das ecuacións de SVD para o tratamento dos dados de RDC para os grupos metilo, metileno e fenilo. Esta modificación foi testada na análise do 8-fenilmentol e derivados del. Finalmente, avaliamos o desempeño da aproximación de tensor único na análise conformacional do alcaloide de quinina. Encontramos que esta aproximación non pode ser aplicada a sistemas onde a troca conformacional provoca grandes mudanzas na forma global da molécula e sería necesario abordar o problema dun xeito mais sofisticado.

Esta tesis describe el desarrollo y aplicación de nuevas metodologías centradas en el análisis estructural de moléculas conformacionalmente flexibles mediante el uso de la RMN en medios orientados.

El uso de los acoplamientos dipolares residuales (RDC) es hoy en día una metodología poderosa para la determinación de la configuración relativa de moléculas orgánicas pequeñas. Desafortunadamente, su uso está limitado a moléculas rígidas o semirrígidas. Es el propósito de esta tesis investigar, mejorar y establecer límites para el uso de la aproximación del tensor único en el análisis de moléculas conformacionalmente flexibles.

Hemos propuesto una modificación de las ecuaciones de SVD para el tratamiento de los datos de RDC en grupos metilo, metileno y fenilo. Esta modificación ha sido testada en el análisis del 8-fenilmentol y derivados. Finalmente, hemos evaluado el desempeño de la aproximación del tensor único en el análisis conformacional del alcaloide quinina. Hemos encontrado que esta aproximación no puede ser aplicada a sistemas donde los saltos conformacionales provocan grandes cambios en la forma global de la molécula, por lo que sería necesario abordar el problema de un modo más sofisticado.

Capítulo 0 . Introducción...13

0.1 Interacción dipolar...15

0.2 Acoplamiento dipolar residual (RDC)...16

0.2.1 El acoplamiento dipolar en muestras sólidas y líquidas...16

0.2.2 El Tensor de alineamiento ...18

0.2.3 Relación entre los RDC observados y el tensor de alineamiento...22

0.3 Análisis de los RDC: determinación del tensor de alineamiento...24

0.3.1 Ajuste de los RDC experimentales a geometrías candidatas...24

0.3.2 Método SVD: descomposición en valores singulares ...25

0.3.3 Evaluación de la calidad del ajuste...26

0.3.4 Tratamiento de errores. Bootstrapping...28

0.4 Métodos de alineamiento molecular ...30

0.4.1 Orientación basada en la susceptibilidad magnética ...30

0.4.2 Orientación con medios de alineamiento ...32

0.4.3 Comprobación experimental del alineamiento...38

0.5 Espectroscopía de RMN: medida experimental de los RDC...39

0.5.1 Espectro 1D 13C acoplado: C-gated-decoupled...39

0.5.2 Espectros HSQC acoplados...41

0.5.3 Acoplamientos CH a larga distancia ...47

0.6 Algunas aplicaciones de los RDC a la determinación estructural ...47

0.6.1 Configuración de C quirales y de H diastereotópicos ...47

0.6.2 Medios de alineamiento quirales: diferenciación enantiomérica y configuración absoluta...48

0.6.3 Signo de la constante de acoplamiento escalar...49

0.7 RDC en moléculas con flexibilidad conformacional...49

0.8 Objetivos...51

Capítulo 1 . Análisis de RDC en moléculas con movilidad interna. Aplicación al 8-fenilmentol...53

1.1 Introducción...53

1.1.1 Molécula modelo: 8-fenilmentol (8pm)...54

1.2 Objetivos...56

1.3 Teoría ...56

1.3.1 Promediado de RDC equivalentes...57

1.3.2 Construcción del sistema de ecuaciones para el tratamiento de RDC equivalentes ...59

1.3.3 Movilidad conformacional. Aproximación del tensor común o Tensor Único...61

1.4 Resultados y discusión ...64

1.4.1 Cálculos computacionales...64

1.4.2 Espectroscopía de RMN del 8PM en medio isótropo...66

1.4.3 Espectroscopía de RMN de 8PM en medio orientado...68

1.4.4 Ajuste de los RDC: metilenos no promediados ...72

1.4.5 Reevaluación de las suposiciones del modelo...78

1.4.6 Ajuste de los RDC: orientación "Super2", metilenos no promediados...79

1.4.7 Ajuste de los RDC: metilenos promediados...80

1.4.8 Tensor de alineamiento...82

1.5 Sección experimental...83

1.5.1 Preparación de muestras orientadas en PELG...83

1.5.2 Espectroscopía de RMN...84

1.5.3 Cálculos computacionales del 8-fenilmentol...84

Capítulo 2 . Análisis conformacional del 8-fenilmentol en geles de PDMS...89

2.1 Introducción...89

2.2 Objetivos...90

2.3 Resultados y Discusión...90

2.3.1 Espectroscopía de RMN de 8pm orientado en geles de Pdms/Cloroformo...90

2.3.2 Ajustes de los RDC del gel PDMS-200...93

2.3.3 Ajustes de los RDC del gel PDMS-480...94

2.3.4 Comparación del alineamiento del 8pm en el cristal líquido de PELG y los geles de PDMS...95

2.4 Conclusiones...96

2.5 Sección experimental...97

2.5.1 Preparación de muestras orientadas en PDMS (método SAG)...97

2.5.2 Espectroscopía de RMN...97

2.6 Apéndice: tablas y gráficas de ajustes de RDC...99

2.6.1 Ajustes de RDC de PDMS-200...99

2.6.2 Ajustes de RDC de PDMS-480...101

2.6.3 Gráficas de dispersión de RDC calculados frente a experimentales...103

Capítulo 3 . Análisis de RDC de derivados del 8-fenilmentol...105

3.1 Introducción: ésteres del 8-fenilmentol...105

3.2 Objetivos...106

3.3 Resultados y discusión: phQ (2)...106

3.3.1 Cálculos computacionales (phQ)...106

3.3.2 Espectroscopía de RMN del derivado quinolina (phQ)...109

3.3.3 Ajustes de los RDC de phQ...111

3.4 Resultados y discusión: phP (3)...114

3.4.1 Cálculos computacionales...114

3.4.2 Espectroscopía de RMN de phP (3)...115

3.4.3 Ajustes de los RDC de phP...117

3.5 Comparación del alineamiento de 8pm y derivados ...119

3.6 Sección experimental...120

3.6.1 Alineamiento de los ésteres en PDMS...120

3.6.2 Espectroscopía de RMN...120

3.6.3 Cálculos computacionales...121

3.6.4 Ajustes de los RDC...121

3.7 Conclusiones...122

3.8 Apéndice: tablas completas de ajustes de RDC ...123

3.8.1 Fenilmentolquinolina (phQ)...123

3.8.2 Fenilmentolpiridil (phP)...125

Capítulo 4 . Determinación de la configuración relativa del intermedio BBC3 mediante RDC ...127

4.1 Introducción...127

4.2 Objetivos...129

4.3 Resultados y discusión...130

4.3.1 Cálculos computacionales...130

4.3.2 Espectroscopía de RMN de BBC3 en medio isótropo...131

4.3.3 Espectroscopía de RMN de BBC3 en medio orientado...132

4.3.4 Ajustes de los RDC con promediado de metilenos...133

4.4 Sección experimental...136

4.4.1 Preparación de la muestra alineada ...136

4.4.2 Cálculos computacionales...136

Capítulo 5 . Análisis Estructural Semiautomático de Retrorsina mediante Acoplamientos

Dipolares Residuales...139

5.1 Introducción...139

5.2 Objetivos ...141

5.3 Resultados y discusión...141

5.3.1 Análisis estructural automático de retrorsina...141

5.3.2 Dicroismo circular...145

5.3.3 Espectroscopía de RMN en medio isótropo...147

5.3.4 Espectroscopía de RMN en medio orientado ...147

5.4 Sección experimental ...149

5.4.1 Preparación de retrorsina orientada en DMSO-d6...149

5.4.2 Modelado molecular y análisis de RDC...150

5.4.3 Espectroscopía de RMN...151

5.5 Conclusiones...151

Capítulo 6 . Análisis conformacional de quinina mediante RDC...153

6.1 Introducción...153

6.1.1 La molécula de quinina...153

6.1.2 Antecedentes del estudio estructural de QNN...155

6.2 Objetivos...157

6.3 Resultados y discusión ...157

6.3.1 Espectroscopía de RMN ...159

6.4 Sección experimental...167

6.4.1 Preparación de muestras orientadas de quinina ...167

6.4.2 Espectroscopía de RMN...167

6.4.3 Cálculos computacionales de quinina ...168

6.5 Conclusiones...168

Conclusions...169

Tabla 0.1...37 Tabla 1.1...65 Tabla 1.2...66 Tabla 1.3...66 Tabla 1.4...67 Tabla 1.5...67 Tabla 1.6...70 Tabla 1.7...73 Tabla 1.8...75 Tabla 1.9...75 Tabla 1.10...75 Tabla 1.11...77 Tabla 1.12...77 Tabla 1.13...79 Tabla 1.14...79 Tabla 1.15...80 Tabla 1.16...81 Tabla 1.17...81 Tabla 1.18...82 Tabla 1.19...82 Tabla 2.1...92 Tabla 2.2...93 Tabla 2.3...94 Tabla 2.4...94 Tabla 2.5...99 Tabla 2.6...99 Tabla 2.7...99 Tabla 2.8...99 Tabla 2.9...100 Tabla 2.10...100 Tabla 2.11...100 Tabla 2.12...100 Tabla 2.13...101 Tabla 2.14...101 Tabla 2.15...101 Tabla 2.16...101 Tabla 2.17...102 Tabla 2.18...102 Tabla 2.19...102 Tabla 2.20...102 Tabla 3.1...107 Tabla 3.2...108 Tabla 3.3...109 Tabla 3.4...110 Tabla 3.5...113 Tabla 3.6...115 Tabla 3.7...116 Tabla 3.8...119 Tabla 3.9...123 Tabla 3.10...123

Tabla 3.12...123 Tabla 3.13...124 Tabla 3.14...124 Tabla 3.15...124 Tabla 3.16...124 Tabla 3.17...125 Tabla 3.18...125 Tabla 4.1...131 Tabla 4.2...132 Tabla 4.3...133 Tabla 4.4...134 Tabla 5.1...142 Tabla 5.2...146 Tabla 5.3...147 Tabla 5.4...149 Tabla 6.1...159 Tabla 6.2...160 Tabla 6.3...160 Tabla 6.4...161 Tabla 6.5...163 Tabla 6.6...163 Tabla 6.7...164 Tabla 6.8...166 Tabla 6.9...167

Figura 0.1...13 Figura 0.2...14 Figura 0.3...15 Figura 0.4...16 Figura 0.5...17 Figura 0.6...19 Figura 0.7...19 Figura 0.8...25 Figura 0.9...27 Figura 0.10...29 Figura 0.11...33 Figura 0.12...34 Figura 0.13...35 Figura 0.14...35 Figura 0.15...36 Figura 0.16...36 Figura 0.17...38 Figura 0.18...38 Figura 0.19...40 Figura 0.20...40 Figura 0.21...40 Figura 0.22...41 Figura 0.23...42 Figura 0.24...42 Figura 0.25...42 Figura 0.26...43 Figura 0.27...43 Figura 0.28...44 Figura 0.29...44 Figura 0.30...45 Figura 0.31...45 Figura 0.32...45 Figura 0.33...46 Figura 0.34...46 Figura 0.35...47 Figura 0.36...48 Figura 0.37...48 Figura 1.1...54 Figura 1.2...55 Figura 1.3...55 Figura 1.4...56 Figura 1.5...57 Figura 1.6...58 Figura 1.7...63 Figura 1.8...65 Figura 1.9...68 Figura 1.10...69 Figura 1.11...69 Figura 1.12...71 Figura 1.13...71

Figura 1.15...71 Figura 1.16...73 Figura 1.17...76 Figura 1.18...81 Figura 1.19...83 Figura 1.20...83 Figura 1.21...83 Figura 2.1...91 Figura 2.2...91 Figura 2.3...92 Figura 2.4...95 Figura 2.5...95 Figura 2.6...96 Figura 2.7...103 Figura 2.8...103 Figura 2.9...104 Figura 2.10...104 Figura 3.1...106 Figura 3.2...107 Figura 3.3...107 Figura 3.4...109 Figura 3.5...111 Figura 3.6...111 Figura 3.7...112 Figura 3.8...114 Figura 3.9...114 Figura 3.10...115 Figura 3.11...117 Figura 3.12...117 Figura 3.13...118 Figura 3.14...118 Figura 3.15...119 Figura 4.1...128 Figura 4.2...128 Figura 4.3...128 Figura 4.4...129 Figura 4.5...130 Figura 4.6...130 Figura 4.7...131 Figura 4.8...131 Figura 4.9...132 Figura 4.10...133 Figura 4.11...134 Figura 4.12...135 Figura 4.13...136 Figura 5.1...140 Figura 5.2...140 Figura 5.3...141 Figura 5.4...142 Figura 5.5...143 Figura 5.6...144

Figura 5.8...145 Figura 5.9...147 Figura 5.10...148 Figura 5.11...149 Figura 6.1...154 Figura 6.2...155 Figura 6.3...156 Figura 6.4...156 Figura 6.5...157 Figura 6.6...158 Figura 6.7...158 Figura 6.8...161 Figura 6.9...161 Figura 6.10...162 Figura 6.11...165 Figura 6.12...165 Figura 6.13...166

B0 Campo magnético externo

B3LYP Becke/Lee-Yang-Parr funcional

CLIP-HSQC Clean in-phase HSQC

CSA Chemical Shift Anisotropy

C-gd Gated decoupled 13_C

DFT Density Functional Theory

GIAO Gauge-independent Atomic Orbitals

IEF-PCM Integral Equation Formalism, Polarizable

Continuum Model

IPCM IsodensityPolarizable Continuum Model kGy kilo Gray, unidad para la absorción de

radiación ionizante

kpt kpt = 1024 pt

MM Mecánica molecular MP Møller-Plesset

PCM Polarizable Continuum Model

PBLG Poli-γ-bencil-L-glutamato

PDMS Polidimetilsiloxano

PELG Poli-γ-etil-L-glutamato

PMMA Polimetilmetacrilato

pt puntos del dominio de tiempo (FID) o de frecuencias (espectro)

RDC Residual Dipolar Couplings

RMSD Root Mean Square Deviation

QM/MM Quantum Mecanics/Molecular Mechanics

SAG Strained Aligning Gel

SVD Singular Value Decomposition

Capítulo 0

. Introducción

La resonancia magnética nuclear (RMN) es, hoy en día, la principal técnica empleada para determinar la constitución, configuración y conformación de las moléculas orgánicas en disolución. La determinación de la constitución se basa principalmente en el análisis de los desplazamientos químicos y las correlaciones por acoplamiento escalar homonuclear (COSY,

TOCSY) o heteronuclear (HSQC, HMBC y sus variantes).[1] _{Una vez conocida la constitución}

molecular, la determinación de la configuración y conformación se basa principalmente en el

análisis de las constantes de acoplamiento escalar (J) y del efecto Overhauser nuclear (NOE).

[2-4] _{Los acoplamientos escalares más utilizados son los vecinales (} 3_J

HH y 3JCH) debido a su

dependencia del ángulo diedro que forman los enlaces covalentes de los núcleos observados. El análisis de las intensidades de NOE proporcionan una estimación de las distancias

internucleares H–H (Figura 0.1).[5, 6] _{Aun reconociendo el éxito de esta metodología, existen}

numerosas situaciones en que estos datos experimentales no son suficientes para resolver el problema en cuestión. En moléculas flexibles con muchos grados de libertad, suele ocurrir

que el número de valores de3_{J y NOE que se pueden medir experimentalmente es, en la}

práctica, insuficiente. El problema se agrava si la molécula o fragmento tiene pocos protones debido a la presencia de insaturaciones o heteroátomos.

Figura 0.1: Ejemplo de uso del NOE para la determinación estructural del alcaloide (–)-misramine.[7]

Los parámetros clásicos 3_{J y NOE proporcionan información estructural de carácterlocal,}

entendiendo por local que establecen relaciones geométricas entre parejas de núcleos que están cercanos entre ellos. Esto permite definir la geometría de pequeños fragmentos moleculares que luego se ensamblan de forma secuencial. En ocasiones la información de carácter local de estos dos parámetros de RMN no se puede usar para establecer correlaciones

entre núcleos más separados debido a la ruptura de la secuencia de información (Figura 0.2).[8,

9] _{Este problema se puede solventar en ocasiones con el uso de losacoplamientos dipolares}

residuales (RDC,residual dipolar couplings). Como se explicará más adelante (sección 0.3),

los RDC proporcionan información estructural de carácterglobal o no local, ya que las

relaciones angulares definidas por los RDC se ajustansimultáneamente en toda la molécula y

no de forma secuencial o fragmento a fragmento.

Figura 0.2: Mientras que en la molécula de la izquierda se pueden relacionar secuencialmente los espines de C3 a C17 a través del acoplamiento escalar, en la molécula de la derecha existe un fragmento magnéticamente inactivo que lo imposibilita.

La introducción de los acoplamientos dipolares residuales (RDC) para el estudio estructural

de moléculas pequeñas es relativamente reciente.[10-14] _{Los avances han ido en general por}

detrás de su aplicación a proteínas en disolución[15, 16]_{, debido principalmente a la dificultad de}

conseguir grados de alineamiento pequeños.

En rigor, el uso de los acoplamientos dipolares de moléculas pequeñas en medios orientados no es nuevo y se remonta al trabajo pionero de Saupe y Englert en 1963, donde estudiaron

benceno en fase líquida cristalina.[17] _{En estas fases el alineamiento observado es fuerte (del}

orden de los 100 Hz o más) haciendo difícil el análisis de los RDC salvo para casos muy

concretos de moléculas sencillas y/o simétricas.[18] _{En estas condiciones los espectros son muy}

complejos, debido principalmente al acoplamiento fuerte originado por el alto grado de alineamiento (Figura 0.3), lo que impide su uso práctico para la determinación de la estructura o geometría de moléculas en general. Esta fue la situación hasta finales de los años 1990, en que se introdujeron los medios de alineamiento débil, donde los RDC observados son del

orden de los acoplamientos escalares (~ 100 _{- 10}2 _{Hz), posibilitando una interpretación más}

directa en la resolución de problemas estructurales de interés práctico. Los ejemplos iniciales

fueron con biomoléculas, carbohidratos, ácidos nucleicos y proteínas.[16, 19-21] _{Desde entonces}

se han ido desarrollando otros medios de alineamiento para obtener grados de alineamiento más débil, al tiempo que se progresaba en los métodos de interpretación de los datos. La aplicación a moléculas orgánicas pequeñas tuvo que esperar hasta que se descubrieron medios capaces de inducir un grado de alineamiento débil en este tipo de compuestos, cuyos requerimientos son diferentes de las proteínas o ácidos nucleicos. No fue hasta 2003 que se

Figura 0.3: Espectro de1_{H RMN en la fase nemática de}

4,4'-diclorobifenil (DCB).[23]

En la primera parte de estaIntroducción se presenta brevemente el origen del acoplamiento

dipolar y el formalismo matemático para la interpretación de los RDC. Después se revisan los métodos de alineamiento de moléculas orgánicas, los métodos de RMN para medir acoplamientos y, finalmente, algunas aplicaciones.

0.1

I

NTERACCIÓN

DIPOLAR

La interacción dipolo-dipolo entre los espines nucleares de una molécula es el origen de la multiplicidad o estructura fina de los espectros de RMN. Hay que distinguir entre dos tipos de interacción dipolar: directa e indirecta.

Lainteracción dipolar indirecta o acoplamiento escalar J se debe a la interacción entre los momentos dipolares magnéticos de electrones y núcleos de una molécula, que se propaga a través de los enlaces covalentes de la molécula. El acoplamiento indirecto es independiente

del campo magnético externo B0 y depende del producto de los espines nucleares,

̂

HJ=2πJISIIIS (0.1)

dondeH es el operador hamiltoniano en unidades rad/s,JIS es la constante de acoplamiento

dipolar indirecta, eII eIS son los operadores de momento angular para los espines nucleares I

y S.

L ainteracción dipolar directa o acoplamiento dipolar D se produce entre cada pareja de espines nucleares directamente a través de espacio, es decir, sin estar mediada por los enlaces covalentes. Esta interacción depende de la distancia internuclear y de la orientación del vector internuclear respecto al campo magnético externo. En el caso heteronuclear, el hamiltoniano para dos espines nucleares I y S viene dado por

̂

HDD=2π DIS IzSz (0.2)

dondeIz y Sz son los momentos nucleares de los espines I y S, y DIS es el valor del

acoplamiento dipolar, que viene definido por

D_IS= κ rIS 3 (3cos2_θ IS−1) 2 (0.3)

donde rISes la distancia internuclear, θISes el ángulo que forman los vectores del campo B0 y

rIS. La constante κ engloba las constantes giromagnéticas (γ) de los espines I y S, la constante

κ=−γIγSμ0ℏ

4π2 (0.4)

Para sistemas homonucleares, el hamiltoniano viene dado por la siguiente ecuación, donde la etiqueta L se refiere al sistema de coordenadas del laboratorio

̂

H=2πD_IS(I_zLS_zL−1

2IxLSxL−

1

2IyLSyL) (0.5)

Figura 0.4: Definición deθIS yrIS en la interacción dipolar.

B0 es el campo magnético externo.

0.2

A

COPLAMIENTO

DIPOLAR

RESIDUAL

(RDC)

0.2.1 E

Caso estático

En un sólido en polvo estático, la muestra contiene moléculas en todas las orientaciones posibles. Teniendo en cuenta que el acoplamiento dipolar I–S depende de la orientación del vector internuclear respecto al campo magnético, la frecuencia de transición de cada molécula toma un valor diferente dado por la ecuación (0.6), en el rango de los kHz. No todos los valores del acoplamientoDIS son igual de probables, ya que no todas las orientaciones del

vector I–S lo son. La intensidad de cada frecuencia es proporcional al número de moléculas con su vector IS formando un ángulo θIS con el campo B0. Así, el acoplamiento dipolar en

Figura 0.5: Doblete de Pake para un espín I acoplado dipolarmente a un segundo espín S.El símbolo d es el desdoblamiento máximo de la frecuencia de resonancia.

Concretamente, en el caso heteronuclear, para cada ángulo θIS la frecuencia de la transición

del espín I es νI= νI ,0 ± 3 4 _rκ3_IS (3 cos 2 θIS−1) (0.6)

donde νI es la frecuencia de la transición del espín I acoplado, y νI,0 es su desplazamiento

químico. La frecuencia de la transición coincide con el desplazamiento químico cuando toma el valor del ángulo mágico, θIS ≈ 54.7º, ya que (3 cos2θmágico – 1) = 0.

La intensidad de cada transición puede intuirse si expresamos el vector intenuclear rIS en

coordenadas esféricas (Figura 0.6) y nos fijamos en la Figura 0.5. Al aumentar el ángulo

cenitalθ de 0º a 90º, también aumenta la longitud de la circunferencia que se obtiene al variar

el ángulo azimutal φ de 0º a 360º. Precisamente, la distribución de probabilidadp(θIS) de las

orientaciones del vector I–S es proporcional a dicha circunferencia [p(θIS) = sen(θIS)].

Caso dinámico: líquido isótropo (movilidad molecular no restringida)

En RMN de líquidos, en cambio, no se observa este desdoblamiento en forma de doblete de

Pake (Figura 0.5). Esto se debe a que θI Sestá constantemente cambiando en cada una de las

moléculas debido a su rápida reorientación durante el experimento, lo que hace que se observe e lpromedio temporal del acoplamiento, que es cero (ecuación (0.7)). Matemáticamente se

puede expresar como la integral sobre todos los valores que toma θIS ∈ [0, π) a lo largo del

tiempo: (3 cos2 θIS−1) =

∫

Caso dinámico: líquido anisótropo (movilidad molecular restringida)

Si por alguna razón el movimiento molecular no es completamente isótropo, la distribución de

probabilidadp(θIS) tendrá otra forma. Según sea esta distribución, habrá casos en que el

promedio temporal del acoplamiento dipolar no sea nulo (ecuación (0.8)). En este caso se observará una fracción del acoplamiento total, que se denomina acoplamiento dipolar

residual (RDC, por residual dipolar coupling). El RDC conserva la misma información estructural que el acoplamiento original (orientación del vector rIS), solo que su valor está

típicos son el 0.01–0.1 % del acoplamiento dipolar máximo). Los métodos para inducir alineamiento molecular se explican más adelante (Sección 0.4 ).

(3cos2

θIS−1) ≠ 0 ⇒ D aniso

≠0 (0.8)

Hay que tener en cuenta que el tensor de acoplamiento escalar, contiene una contribución

isótropa y otra anisótropa. La componente isótropa no se anula en condiciones de movilidad molecular no restringida (condiciones isótropas) ya que se propaga a través de los enlaces químicos y es independiente de la orientación respecto al campo estático. En cambio, la contribución anisótropa se cancela en condiciones de movilidad isótropa y solo reaparece en medios orientados, de forma análoga al acoplamiento directo. No obstante, suele despreciarse, ya que es de magnitud insignificante cuando se compara con el acoplamiento dipolar directo, especialmente para los acoplamientos más relevantes C–H o H–H.

0.2.2 E

T

Para calcular la relación entre el acoplamiento dipolar y la geometría molecular, es

conveniente introducir eltensor de alineamiento. Supongamos una molécula rígida, donde la

distancia rIS es constante, de forma que la dependencia del acoplamientoDIS con el tiempo es

solamente debida al movimiento rotacional de la molécula (el tratamiento de moléculas flexibles se discute en la Sección 0.7 ) . Consideraremos dos sistemas de referencia, uno

estático o de laboratorio y otro interno a la molécula (L, laboratorio; M, molecular). El sistema

de coordenadas interno de la molécula puede elegirse arbitrariamente y está fijo dentro de ella, experimentando todos los movimientos de la molécula a medida que rota sobre sí misma.

La orientación del vector internuclearrIS en la molécula rígida se puede describir en el sistema

de coordenadas del laboratorio (Figura 0.6), donde el campo magnético externo apunta en la

dirección del eje Z, mientras que la orientación del vector rIS va cambiando a medida que la

molécula rota en disolución. También es posible describirlo desde el sistema de referencia

solidario con la molécula, en el que el vector internuclearrIS mantiene su orientación

constante, mientras que el vector del campo B0 se reorienta con el movimiento molecular.

En cualquier caso, el término angularθ y por tanto el acoplamiento dipolarDIS son

dependientes del tiempo. El acoplamiento dipolar promedio en el tiempo puede escribirse como

D = κ

r3

(

3 cos2θ −1

2

)

Figura 0.6: Definición del ángulo φ y θ, empleados para la definición del acoplamiento dipolar. Los ángulos están expresados en el sistema de ejes principal, el sistema de laboratorio.

Para expresar la evolución del ánguloθ en el sistema de referencia molecular, se hacen las

siguientes transformaciones de coordenadas (Figura 0.7). El vector internuclearrIS forma los

ángulosαx,αy yαz con los ejes principales del sistema de coordenadas molecular (XM, YM y

ZM). La orientación relativa de los dos sistemas de coordenadas L y M viene descrita por los

ángulosβx, βy yβz, que son los ángulos directores del campo magnético externoB0 en el

sistema de referencia molecular (B0 coincide con eje ZL del sistema del laboratorio). La

definición de estos ángulos viene dada en la Figura 0.7. En el sistema de referencia interno de

la molécula M, el vector intenuclear rIS es constante en magnitud y orientación (los ángulos αx,

αy yαz son invariantes), mientras que la orientación del campo magnético es dependiente del

tiempo (los ángulos directoresβx, βyy βz varían con la reorientación molecular). Con estas

relaciones, la parte angular de la ecuación (0.9) se puede expresar en función de los ángulos directores (αxαyαz) y (βx βyβz) como se muestra en las ecuaciones (0.10) y (0.11).

Figura 0.7: Relación entre los sistemas de coordenadas del laboratorio (L) e interno o molecular (M). El vector internuclearrIS forma los ángulos (αx,αy,αz) con los ejes principales del sistema de coordenadas

molecular (XM, YM, ZM).La orientación relativa de los dos sistemas de coordenadas viene dada por los

ángulos (βx, βy, βz).

De la ecuación (0.9) Con estas definiciones, el término cos(θ) se puede expresar como el producto escalar de los vectores que contienen los cosenos directores (ecuación (0.10))

cosθ =

[

]

[

cosβx

cosβy

cosβz

]

=cosαx cosβx+cosαy cosβy+cosαz cosβz

(0.10)

Por tanto, la parte angular del acoplamiento dipolar (ecuación (0.9)) es 3 cos2θ −1

2 =

3

2 ⋅ [cosαx cosβx+cosαy cosβy+cosαz cosβz]

2

− 1₂ (0.11)

Para simplificar la notación se define: Ci = cosαi y ci = cosβi. Como se supone que la molécula

es rígida, los términos Ci son constantes y no es necesario promediarlos en el tiempo.

3 cos2θ −1 2 = 3 2 [cx 2 Cx 2 +cy 2 Cy 2 +cz 2 Cz 2 ] + + 3₂ [ 2 c_xc_y C_xC_y + 2 c_xc_z C_xC_z + 2 c_yc_z C_yC_z] − 1₂ (0.12)

En la ecuación (0.12) podemos identificar los términos que codifican la orientación promedio de la molécula con respecto al campo magnético :

cx 2 , cy 2 , cz 2 , cxcy, cxcz y cycz (0.13)

Estos términos se pueden relacionar con las componentes deltensor de orden Ŝ, también

llamado matriz de Saupe. Siguiendo la definición de Saupe[17] _{y usando}

S_kl= 3 cosβk cosβl − δkl

2 (0.14)

donde δkl es la delta de Kronecker, que toma los valores δkl =

{

}

De acuerdo con esta definición, la ecuación (0.12) puede escribirse en función de las

componentes de la matriz de Saupe Ŝ, como sigue

3 cos2

θ −1

2 = _k=

∑

∑

Y el acoplamiento dipolar del par de espines IS queda expresado como

D_IS = κ

r3_IS k=

∑

∑

(S_kl C_k C_l) _(0.16)

Es más conveniente expresar esta relación (0.16) en forma de producto matricial (la matriz de Saupe multiplicada por izquierda y derecha por el vector de los cosenos directores del vector IS en el sistema de referencia molecular).

3 cos2θ −1

2 =

[

]

[

S_xx S_xy S_xz S_yx S_yy S_yz S_zx S_zy S_zz

][

]

Puede apreciarse en esta expresión que la matriz de Saupe contiene toda la información sobre el promediado temporal de la reorientación molecular, ya que los cosenos directores del vector IS están fijados para una geometría rígida dada. Alternativamente, se suele utilizar el

tensor de alineamiento Â, que es proporcional al tensor de orden Ŝ:

̂

S= 3₂ Â (0.18)

Para expresar el acoplamiento dipolar promedio en función del tensor de alineamiento Â,

reorganizamos la ecuación (0.9) D_IS = 3₂ κ r3 3 cos2θ − 1 3 = 3 2 _rκ3

(

)

Para expresar estas relaciones en forma matricial, se define un vector unitariouIS colineal con

el vector internuclearrIS . Las componentes deuIS son los cosenos directores (cos αx, cos αy,

cos αz) del vector que une los espines IS en el sistema de referencia molecular M. Esta

notación también se simplifica como uIS= (xIS, yIS, zIS).

u_IS = ⃗rIS

∣⃗rIS∣

=

(

)

Así, el término angular de la ecuación (0.19) se puede expresar como cos2

θ − 1₃ = 3 cos

2

θ − 1

3 = uIST A û IS (0.21)

Es decir, en forma expandida,

cos2θ − 1

3 =k=

∑

∑

Aklcosαkcosαl =

=

[

]

[

A_xx A_xy A_xz Ayx Ayy Ayz Azx Azy Azz

] [

]

Y el RDC de los espines IS (DIS) queda expresado en función del tensor de alineamiento y del

vector internuclear como sigue

DIS = 3 2 _rκ_IS3 uIS T ̂ A uIS = κ rIS 3 uIS T ̂ S uIS (0.23)

Esta ecuación es una forma muy conveniente para expresar la relación entre el acoplamiento y la geometría molecular, por lo que la retomaremos en la Sección 0.2.3 .

Propiedades del tensor de alineamiento

El tensor de alineamiento es un tensor de orden 2 se representa como una matriz 3×3. Es

una matriz simétrica respecto a la diagonal principal (Akl = Alk) con traza nula,

(Axx + Ayy + Azz= 0). Por tanto, solo 5 de sus 9 componentes son diferentes. Es por esto que

más adelante veremos que necesitamos al menos 5 valores experimentales linealmente independientes para su determinación. Conociendo las coordenadas cartesianas de cualquier

vector internuclear, podremos predecir su RDC siempre que las componentes del tensor de

alineamiento sean conocidas, empleando la ecuación (0.23).[24]

La diagonalización de la matriz nos proporciona un nuevo sistema de coordenadas llamado

sistema principal de alineamiento. Sus ejes X, Y, Z se suelen definir, por convención, en función del tamaño de sus autovalores: ǀAxǀ ≤ ǀAyǀ ≤ ǀAzǀ.

El tensor de alineamiento se puede caracterizar también con sus componentesaxial Aa y

rómbicaAr, definidas como sigue

Aa=

3

2 Az = Sz (0.24)

A_r= A_x−A_y = 2₃ ( S_x−S_y) (0.25)

La componente rómbica mide la desviación del tensor de la simetría axial. Se definen también la rombicidadR y el parámetro de asimetría η:

R= Ar Aa (0.26) η = Ax− Ay Az = Sx−Sy Sz = 3 2 R (0.27)

Puede expresarse la relación entre el acoplamiento dipolar y las coordenadas polares del vector internuclear en el sistema de ejes principal, obteniéndose una relación sencilla en función de las componentes axial Aa y rómbica Ar:[24]

D_IS = 1₂ κ

r3

[

2

ϑ −1) + 3₂ A_r (sin2

ϑcos 2φ)

]

donde κ agrupa las constantes definidas en la ecuación (0.4), ϑ y φ son las coordenadas

polares del vector internuclearrIS en el sistema principal de alineamiento yr es la distancia

internuclear.

0.2.3 R

RDC

ALINEAMIENTO

La ecuación (0.23) relaciona los RDC observables con el tensor de alineamiento y con la

geometría molecular. Es conveniente modificar ligeramente la notación, empleando

subíndicesi, j, k... para referirse a los pares de espinesIS. También se omitirá en adelante la

barra indicadora del promediado temporal, entendiéndose que se trata de acoplamientos dipolares residuales.

D_IS ⇔ D_IS ⇔ D_j ⇔ D_j (0.29)

Con esta nueva notación, la ecuación (0.23), que relaciona el RDC delj-ésimo par de espines

D_j = 3₂ κ

r3_j uj T _{A u}̂

j (0.30)

donderj es la distancia internuclear y uj es el vector unitario en la dirección que une los dos

espines acoplados.

Se define el acoplamiento dipolar reducido dj como

d_j = 2₃ rj 3

κ Dj (0.31)

de modo que la ecuación (0.30) queda reducida a

d_j = u_jT _{A u}̂

j (0.32)

Con esta ecuación (0.32) se pueden predecir todos los acoplamientos dipolares residuales de

una molécula (dj oDj, j = 1, 2, 3 ...) si se conoce la geometría molecular y el tensor Â. A la

inversa, si conocemos un número suficiente de RDC experimentalesDj (j = 1, 2, 3... n),

podemos calcular el tensor de alineamiento a partir de ellos si disponemos de un modelo de la

geometría molecular, como se explica a continuación.[25]

Si se dispone de valores de acoplamientodj determinados experimentalmente, paran pares de

espines en una molécula, se puede plantear una ecuación como la (0.32) para cada uno de

ellos. Esto define un sistema den ecuaciones lineales. Si se dispone de un modelo de

geometría molecular, las únicas incógnitas son las componentes independientes del tensorÂ

que, como se ha mencionado, tiene 9 componentes, pero solo 5 son independientes. La ecuación (0.32) se expande a d_j =

[

]

[

] [

]

dondexj,yj,zj son las componentes (cosenos directores) del vector unitariouj. Esta ecuación

se transforma en (0.34) teniendo en cuenta que el tensor de alineamiento es una matriz

simétrica (Akl = Alk) y de traza nula (Axx = Azz – Ayy).

dj =

[

]

[

]

La aplicación de la ecuación (0.34) a losn acoplamientos determinados experimentalmente

[

]

[

]

[

]

donde losn valores experimentalesdj forman un vector columnad, las 5 componentes

linealmente independientes del tensor de alineamiento aparecen como otro vector columna Â,

y los productos de cosenos directores aparecen en una matriz de dimensión n × 5, que se

denominamatriz de geometría (M). Cada una de las filas deM contiene la descripción de un

vector molecular rj. Podemos excribir la misma ecuación de forma compacta

d = ̂M Â (0.36)

El sistema tiene, por tanto, 5 incógnitas (las componentes independientes deÂ) yn

ecuaciones. Por tanto, tendrá una solución determinada si disponemos al menos de 5 dj

experimentales que correspondan a vectores linealmente independientes. En la práctica, en la

mayoría de las ocasiones el sistema está sobredeterminado, al disponerse de n > 5 RDC

experimentales. En estos casos, el sistema den ecuaciones se resuelve para que el ajuste entre

el modelo (geometría), el tensor y los valores experimentales, sea óptimo en el sentido de

mínimos cuadrados.[ 2 5 ]_{Cabe señalar que este procedimiento requiere que se conozca de}

antemano la geometría molecular. Si no es así, deben proponerse estructuras candidatas generadas por métodos computacionales, evaluando en cada caso el tensor que les correspondería y la calidad del ajuste a los datos experimentales. En la Sección 0.3 se explica con más detalle este procedimiento.

0.3

A

NÁLISIS

DE

LOS

RDC:

DETERMINACIÓN

DEL

TENSOR

DE

ALINEAMIENTO

0.3.1 A

RDC

CANDIDATAS

El procedimiento más habitual para analizar los RDC consiste en generar una serie de modelos moleculares (geometrías candidatas) y evaluar la calidad de su ajuste a los datos experimentales. Los modelos pueden generarse por cualquier método que se considere aceptable, típicamente mediante modelado molecular al nivel de cálculo que sea factible o se

considere necesario (como mecánica molecular, oab initio), o a partir de estructuras

preexistentes, por ejemplo cristalográficas. El procedimiento difiere según se trate de moléculas pequeñas o de bimoléculas (proteínas y ácidos nucleicos).

El problema se formula teniendo en cuenta el sistema de ecuaciones lineales descrito por la

ecuación (0.36). El vectord contiene los acoplamientos residuales experimentales (Djexp),

convenientemente transformados en los valores reducidos (djexp). La matrizM se construye a

partir de la geometría candidata. Las incógnitas del sistema son las 5 componentes del vector

columnaÂ. Típicamente el sistema está sobredeterminado por tener más ecuaciones (valores

experimentales,n > 5) que incógnitas (= 5). El sistema de ecuaciones se puede resolver por

cualquier método matemático de los existentes, siendo los más típicos el SVD (singular value

decomposition)[25] _{y los métodos de minimización (por ejemplo el de Powell o el de}

Levenberg-Marquardt). La solución proporciona las componentes del tensor de alineamiento

(vector columnaÂ), a partir del que se pueden calcular los acoplamientos dipolares

correspondientes al modelo molecular (djexp o Djexp) en forma de un nuevo vector columna dcalc.

dcalc = ̂M Â (0.37)

La calidad del ajuste se evalúa por comparación de los acoplamientos dipolares experimentales (Djexp) y calculados para el modelo (Djcalc).

Si hay más de una geometría candidata, el método se aplica a cada una de ellas (matrices de geometríaM1, M2, ...Mk), obteniéndose para cada modelo un tensor (Â1, Â2, ...Âk) y un

conjunto de acoplamientos calculados (d1calc, d2calc, ... dkcalc). Aquel modelo que dé un ajuste de

mejor calidad se considera la solución al problema. La Figura 0.8 resume gráficamente el procedimiento.

Figura 0.8: Diagrama del método de ajuste de un conjunto de geometrías candidatas a los RDC experimentales.

0.3.2 M

SVD:

El método dedescomposición en valores singulares (SVD,singular value decomposition) fue

introducido para el análisis de RDC por Prestegard[25] _{Consiste en una factorización de la}

M = U⋅ Σ⋅VT = U

[

]

dondeU es una matrizn × m, Σ es una matriz diagonalm × m yVT_{es una matriz unitaria}

n × n. Los elementos de la diagonal principal deΣ son losvalores singulares deM. De

acuerdo con esta descomposición la inversa de M se calcula como

M−1

=V

[

(

)

]

T

(0.39)

y la ecuación(0.35) se resuelve como

A=V

[

(

)

]

T_d

(0.40)

En la ecuación (0.35) m es siempre cinco (el número de elementos del vector Â). Si el sistema

de ecuaciones no tiene solución única, como en el caso de sistemas sobredeterminados

(n > m), el método SVD proporciona una solución que es la óptima en el sentido de mínimos

cuadrados. De cualquier forma, si el sistema no está bien definido con al menos cinco vectores linealmente independientes, pequeños cambios en los valores de entrada se traducirán en grandes cambios en el tensor de alineamiento así calculado. Esto se puede

caracterizar mediante el número de condición (c.n., condition number), definido como

c.n.=

∣∣

∣

∣

∣∣

∣

∣

Valores grandes del número de condición (cn > 100) indican que no hay suficientes vectores

linealmente independientes en el cálculo y que el problema está mal condicionado.

0.3.3 E

Se han propuesto distintos factores de calidad para evaluar el ajuste de los modelos a los RDC experimentales. Además, se deben analizar críticamente los resultados junto con el resto de

información experimental o computacional disponible. Además de los factores de calidad o

funciones de mérito, conviene evaluar las componentes del tensor de alineamiento, el número de condición, o la representación gráfica de los valores Dcalc _{frente a D}exp_.

Factor de calidad Q

La forma más sencilla de evaluar la calidad de un ajuste consiste en sumar los cuadrados de las diferencias entre los valores experimentales y los calculados del parámetro ajustado. En este caso, este principio se aplica a los acoplamientos (Dcalc _{frente aD}exp_{). El llamado}

habitualmente factor de calidad de Cornilescu (QC)[26] escala la suma de los cuadrados de los

residuos con el tamaño de los acoplamientos. Es adecuado para comparar conjuntos de datos experimentales medidos en diferentes medios de alineamiento con diferentes grados de orden.

QC =

√

∑

∑

Este factor debe corregirse si se aplica algún factor de pesadawi a algún valor experimental,

como sucede a veces al promediar vectores (ver Sección 0.2.3 ), de tal forma que la ecuación queda Q_{C , w} =

√

∑

∑

No hay un consenso respecto a qué función de mérito o factor de calidad es el óptimo. Otros autores expresan este ajuste de datos experimentales frente a calculados de diferentes formas, por ejemplo, incluyendo un término que pondera cada valor experimental con su error de medida σi[27] Q_σ =

√

∑

(

)

∑

(

)

Hofmann etal.[28, 29] _{incorporan dicho error experimental como una relaciónn/χ}2 _{entre el}

número de acoplamientos experimentales (n) y la función χ2 _{, que toma en cuenta el error de}

cada dato experimental

χ2 =

∑

(

)

Comparación Dcalc _{vs D}exp

Conviene inspeccionar visualmente la calidad del ajuste mediante una representación gráfica

deDcalc _frenteDexp _{(Figura 0.9). En un ajuste perfecto, todos los puntos estarían en la diagonal}

principal.

Figura 0.9: Representación deDcalc_vsDexp_{. Ejemplos de ajustes bueno}

Selección del modelo: parámetro AIC

En el caso de moléculas con flexibilidad conformacional, el ajuste de los RDC se debe realizar a un conjunto de confórmeros ponderado con sus poblaciones. Una cuestión que se plantea es cuántos confórmeros se deben incluir en el colectivo, teniendo en cuenta que la

inclusión de miembros adicionales va a mejorar el ajuste en el sentido de reducir χ2 _{(suma de}

los cuadrados de los residuos), ya que se aumenta el número de parámetros ajustables. Es posible, por tanto, que se estén incluyendo conformaciones espúreas para artificialmente

reducirχ2_{. El objetivo es, por tanto, seleccionar un modelo mínimo (subconjunto con el}

mínimo número de confórmeros y, por tanto, de parámetros ajustables) que sea compatible

con los datos y errores experimentales. Elcriterio de información de Akaike (AIC,Akaike

Information Criterion)[30]_{, es una medida de la calidad de un modelo, que penaliza la inclusión}

de parámetros o confórmeros adicionales. Se ha aplicado en varias ocasiones al ajuste de

RDC.[31] _{El AIC se define como}

AIC = χ2

+2k (0.46)

dondek es el número de parámetros independientes del modelo. El ajuste óptimo será el qué

dé un valor de AIC más pequeño.

0.3.4 T

. B

.

De las ecuaciones (0.44) y (0.45) surge la cuestión de cómo se tratan los errores experimentales. Dichas ecuaciones tratan de incluir en el ajuste el error individual de cada RDC. También se emplean métodos de remuestreo para estimar el error en la determinación del tensor de alineamiento.

Bootstrapping

A partir de los RDC experimentales, se generan aleatoriamente nuevos conjuntos de RDC simulados. Estos datos simulados se ajustan a las geometrías, obteniéndose valores del tensor de alineamiento. La distribución de valores calculados del tensor proporciona una estimación

del error o imprecisión en  como consecuencia de la imprecisión en los datos

experimentales.

Más concretamente, losn RDC experimentales Djexp se presentan en forma del vector columna

Dexp_, Dexp =

[

]

Se generan un total P de vectores simulados Dksml (k = 1, 2, ..., P) mediante el muestreo de una

la imprecisión en la medida experimental deli-ésimo RDC, y puede presentar diferentes

valores para cada Diexp o puede usarse un valor global uniforme.

D_ksml =

[

]

CadaDksml se ajusta a la geometría molecularM, obteniéndose un tensor de alineamiento

Âksml. A partir de cada tensorÂksml yM se recalculan los acoplamientos Dkrecalc predichos con

el modelo y, a partir de estos, se evalúa el factor de calidad QCsml. La distribución de valores

calculados del tensor proporciona una estimación del error o imprecisión en (orientación y

tamaño). Típicamente, en este tipo de cálculos se suele mostrar la distribución de los ejes del sistema principal de alineamiento en una proyección bidimensional de Sanson-Flamsteed (Figura 0.10). Una limitación delbootstrapping es que muchos de los datosDkrecalc no son

compatibles con los datos experimentales por diferir de ellos mucho más que el error experimental.

Figura 0.10: Captura de pantalla del programa MSpin. Se muestran el tensor calculado (arriba izquierda) y la proyección 2D del tensor (arriba derecha).

Método de Montecarlo

Esta es una adaptación del método propuesto por Prestegard y colaboradores.[25] _{Es un}

refinamiento del método debootstrapping. Consiste en filtrar los datos simulados, rechazando

todos las simulaciones en que los RDC recalculados difieren de los valores experimentales en

más de un valor de corte determinado σ. Formalmente, la simulaciónk-ésima se acepta si

cumple la siguiente condición:

∣

∣

,∀ i=1,2,...n (0.49)

siendoσicalc el error permitido para el acoplamientoi-ésimo. El valor deσicalc puede ser

uniforme para todos los datos, o puede tomar valores diferentes para cada uno de los

acoplamientos. Típicamente,σicalc se hace coincidir con la imprecisión del valor experimental

σi y con la σ de la distribución gaussiana empleada en la simulación. El conjunto de

los datos experimentalesdentro del error experimental. Los estadísticos de esta distribución se usan para evaluar la imprecisión en el tensor de alineamiento y la calidad del ajuste.

0.4

M

ÉTODOS

DE

ALINEAMIENTO

MOLECULAR

Para poder observar cualquier parámetro anisótropo de RMN, como son el acoplamiento cuadrupolar, el acoplamiento dipolar residual o la anisotropía del desplazamiento químico, es necesario inducir cierto orden molecular para que haya alguna orientación preferente, de

manera que el factor (3 cos2 _{θ – 1) no se promedie a cero. Los dos mecanismos principales}

son: (a) el alineamiento de las moléculas en presencia de un campo magnético intenso debido

a su susceptibilidad magnética, y (b) el uso de los llamadosmedios de alineamiento, que

típicamente poseen cavidades de tamaño nanométrico con simetría no esférica. Los medios de alineamiento más utilizados son cristales líquidos y geles poliméricos.

0.4.1 O

Macroscópicamente, todas las sustancias se pueden clasificar según su comportamiento frente a un campo magnético externo. Muchas sustancias solo manifiestan un momento magnético macroscópico cuando se encuentran en presencia de un campo magnético externo. El

momento magnético inducido por unidad de volumen (μV

inducido) depende de su naturaleza y

también, para los sólidos cristalinos, de la orientación relativa del cristal con respecto al

campo magnético externoB0, caracterizándose por un tensor de susceptibilidad magnética

adimensional χV.[32, 33] ⃗μinducido V = μ−0 1 _̂χ V ⃗B0 (0.50)

Si se define la susceptibilidad magnética del volumen de muestraχmol, el momento magnético

puede expresarse como una propiedad molar magnéticaμinducido, quedando expresado en

unidades de J·Tesla-1_·mol-1 _{como sigue:}

⃗μinducido mol

= μ−0 1

̂χmol ⃗B0 (0.51)

El tensor de susceptibilidad magnética χmol se representa mediante una matriz de rango 2

(ecuación 0.52) en la que sus elementosχijrepresentan la componente del momento inducido

por el componente j-ésimo de B0 en el eje i-ésimo.

̂χ =

[

χzx χzy χzz

]

(0.52)

Existe un sistema de coordenadas (llamado sistema principal del tensor) en el que la matrizχ

̂χ =

[

0 0

0 χy' 0

0 0 χz '

]

(0.53)

La energía de interacción por mol (ΔE) entre el momento molecular inducido y el campo externo viene dada por

ΔE = − ⃗μinducido mol _⃗B 0 2 = 1 2

(

₎

donde las primas se refieren al sistema principal del tensor.

Las moléculas con simetría menor que la tetraédrica poseen al menos dos componentes principales diferentes y, por tanto, un comportamiento anisótropo con respecto al campo externo B0. Por tanto, la energía de la interacción ΔE varía según sea la orientación de la

molécula en el campo. Por ejemplo, la energía de interacción del benceno es casi tres veces mayor (–94.6 ppm cgs) cuando el campo es perpendicular al plano del anillo que cuando está en el plano (–34.9 ppm cgs), siendo preferida, por tanto, la primera orientación (1 ppm cgs = 4π·10-12 _m3 _·mol-1_).[34]

Sistemas diamagnéticos

No obstante, en moléculas diamagnéticas pequeñas, la diferencia de energía entre las

orientaciones es mucho menor quekBT y, por tanto, se ve superada por la agitación térmica a

temperatura ambiente (kB: constante de Boltzmann). En consecuencia, su alineamiento en los

campos usados en RMN es habitualmente despreciable y sus propiedades anisótropas no se pueden observar. Sin embargo, al ser la susceptibilidad una propiedad extensiva, la suma de contribuciones individuales en sistemas poliméricos o autoensamblados (como es el caso de los cristales líquidos) puede producir un sistema supramolecular con una anisotropía magnética lo bastante grande como para hacer posible la observación de propiedades anisótropas de RMN. Además, también se puede observar alineamiento en otras moléculas pequeñas que interaccionen con estos sistemas macromoleculares orientados.

El sistema autoensamblado y autoalineado arquetípico son los cristales líquidos, sobre todo los formados por mesógenos aromáticos con susceptibilidad magnética grande. Muchas de estas fases nemáticas se alinean espontáneamente en presencia de los campos magnéticos típicos de RMN. De hecho, el origen de la RMN en medios orientados se basa en los trabajos

pioneros de Saupe,[17] _{que usó cristales líquidos como medios para alinear moléculas de soluto}

pequeñas.[18, 35]

En los trabajos iniciales el grado de orden inducido por las fases nemáticas era muy grande, haciendo muy difícil el análisis de los espectros debido al acoplamiento fuerte. Con posterioridad se introdujeron fases liotrópicas diluidas, en las que el mesógeno forma el cristal líquido en presencia de un cosolvente como agua o algún disolvente orgánico. En estas condiciones el grado de orden es mucho menor (≈ 0.1 % – 1 %), de modo que el acoplamiento dipolar residual es de magnitud similar a los acoplamientos escalares. En estos casos se habla demedios de alineamiento débil. El análisis de los espectros es mucho más sencillo por tener muy atenuado el efecto del acoplamiento fuerte.