Histones: un objecte material de recerca
5.8. Estructura i evolució de les histones
Paral·lelament als estudis estructurals i de caracterització de les fraccions històniques, també es va prestar atenció a aspectes de caire evolutiu. L’estabilitat que presentaven les histones pel que feia a la seva composició era considerada com un indicador de que la seva funció, encara no clarament establerta en aquells moments, es donaria d’una manera molt definida en la cèl·lula, pel fet que aquestes proteïnes no RILL & VAN HOLDE(1973). J. Biol. Chem., 248, 1080-1083.
295 HEWISH & BURGOYNE (1973). Biochem. Biophys. Res. Commun., 52, 504.
296 KORNBERG (1974). Science, 184, 868. La unitat repetitiva de la cromatina seria un fragment
d’unes dues-centes parelles de bases al qual es trobarien unides nou molècules de histona, dues de cada classe, excepte de la h1 (antiga f1), de la qual n’hi hauria dues. Les unions esmentades entre el DNA i les histones de tipus electrostàtic, hidrofòbiques o ponts d’hidrogen, depenent de l’aminoàcid del que es tracti. Informació obtinguda de SUBIRANA (1985).
297 La nomenclatura clàssica és a JOHNS & BUTLER (1962). “Further Fracctionations of Histones
from Calf Thymus”. Biochem. J., 82, 15. La nomenclatura moderna és a BRADBURY (1975). “Histone Nomenclature” a The Structure and Function of Chromatine, FITZSIMMONS & WOLSTENHOLDM (eds), CIBA Foundation Symposium, 28, Amer. Elsevier, NY, 4. Com es veurà més endavant, el grup del DQM va presentar un treball de difracció de RX a aquesta reunió. La informació referida a la discusió de la nova nomenclatura em va ser proporcionada per Joan Antoni Subirana, durant una conversa mantinguda al seu despatx el dia 5 de març de 2007.
toleraven canvis en la seva composició en aminoàcids. Tampoc no es coneixien quins podrien ser els canvis tolerables per les diferents fraccions històniques en diferents organismes, ja que s’havien fet pocs estudis en aquest sentit.
A principis de la dècada dels 1970s, a la vista de les semblances generals en la composició, localització i en relació amb la seva funció al nucli de la cèl·lula, semblava clar que moltes, sinó totes les fraccions, tindrien un origen evolutiu comú en algun polipèptid més primitiu i la confirmació d’aquesta idea hauria de venir d’un estudi comparatiu de les seqüències d’aquestes proteïnes (Johns, 1971; Phillips, 1971).298
La qüestió de la diferenciació de les histones al llarg de l’evolució havia estat sempre present en els interessos de recerca de Subirana i Palau i es va seguir treballant en aquesta línia i amb els materials d’estudi habituals.299 L’any 1973, des de
Barcelona, Subirana, Palau i els seus col·laboradors van publicar un treball al voltant de la caracterització de les protamines i altres proteïnes bàsiques dels espermatozous dels mol·luscs, en el qual es va proposar un patró evolutiu d’aquestes proteïnes. Aquest treball ha ser considerat com un producte dels objectius del projecte presentat als NIH (Figura 25).300
Fins llavors, els estudis de les protamines presents als espermatozous s’havien restringit a algunes espècies de peixos, però poc abans de la publicació d’aquest treball, la situació estava canviant. Tot i que les protamines havien estat estudiades durant quasi un segle, es coneixien poques seqüències d’aquestes proteïnes. La simplicitat de la seva composició en aminoàcids, la seva mida i la seva estructura va portar a classificar-les com proteïnes primitives, més que les histones. Per aquesta raó, un aspecte important de les seqüències de les protamines era que podien donar
298 Els primers intents de fraccionar protamines havien inclòs, entre d’altres, mètodes de
distribució contracorrent, electroforesi en solució lliure, diferències de solubilitat, cromatografia en paper i, potser el de més èxit, la cromatografia en columna d’alúmina. L’any 1961, fent servir aquest tipus de cromatografia, es va separar la cupleina en dues fraccions. Vegeu ANDO & WATANABE (1969). Int. J. Protein Res. 1, 221.
299 El treball esmentat és SUBIRANA (1970b), presentat al FEBS Symposium de 1970.
300 SUBIRANA, COZCOLLUELA, PALAU i UNZETA (1973). Ja l’any 1969, havien publicat un treball
que s’hi troba relacionat: PALAU, RUIZ-CARRILLO i SUBIRANA (1969). Aquest havia estat un dels pocs treballs dedicats a l’estudi dels esprrmatozous d’equionoderms. En aquest sentit, la publicació de 1973 el completava. Aquest nou treball va ser finançat pel grant del Population Council.
claus importants al voltant de l’estructura i evolució de les histones i la nucleohistona.301
Com que s’acceptava que les proteïnes haurien evolucionat pel canvi de certs aminoàcids de les seves seqüències i també a partir de proteïnes més curtes i menys complexes, era millor examinar les histones per trobar evidències d’aquests canvis. Això es podia fer trencant una seqüència en fragments i ordenant-los de manera que s’obtingués la màxima coincidència entre els residus aminoàcids d’aquests grups. 302
Subirana, Palau i els seus col·laboradors van descriure les proteïnes obtingudes dels espermatozous d’algunes espècies de mol·luscs, phyllum zoològic que inclou una àmplia varietat d’animals que pertanyen a una branca evolutiva diferent que els vertebrats. El treball volia mostrar la considerable varietat en mida i composició de les proteïnes associades al DNA als espermatozous. Les proteïnes es van obtenir per mètodes de fraccionament i, posteriorment, es va estudiar la seva mobilitat electroforètica, aspecte en el qual, aquest treball també va ser pioner.303
En funció de les espècies, les gònades masculines es van obtenir per centrifugació, homogeneïtzació o agitació i l’obtenció dels nuclis es va verificar per microscòpia de contrast de fases.304 Si bé en diversos casos es van introduir variants,
la preparació de les proteïnes, en general, es va fer seguint els mètodes de Johns, protocol consistent en una successió de medis d’acidesa creixent i la comprovació en
301 Durant la dècada dels 1960s s’havia completat la seqüència de set protamines que s’havien
obtingut de caps d’esperma de tres espècies de peix: l’areng del pacífic (Clupea pallasii), dues espècies de truita (Salmo gairdnerii i Salmo irideus) i del Onchorhyncus keta (Chum o keta salmon), els les quals s’hi havia trobat més d’una protamina (Treballs de Ando i Watanabe (1969) a Int. J. Protein Res. 1, 221). La presència de tota una sèrie de homologies en aquestes proteïnes va portar a plantejar hipòtesis sobre la seva evolució.
302 Aquesta anàlisi va ser desenvolupada per a un estudi de la haptoglobina i va ser ampliat a les
clupeines (de l’areng) per BLACK & DIXON (1967), Nature, 216, 152-153.
303 En relació amb la importància d’aquest treball, vegeu les cites al SCI a la taula 1 de l’annex 1.
Vegeu també AUSIÓ (2001).
304 Les espècies estudiades varen ser les següents: Chiton olivaceus (quitón verd, poliplacòfor);
Gibbula divaricata (baldufa mediterrània); Haliothis tuberculata (orella de mar); Patella vulgata (lapa); Loligo forbessi (calamar). Totes aquestes espècies es varen obtenir a L’Escala, Girona, Costa Brava. Cryptochiton stelleri va ser obtingut de la costa del Pacífic dels EUA. Loligo vulgaris (calamar), Mytilus edulis (musclo vulgar) i Ostrea edulis (ostra) es varen obtenir de la costa atlàntica de Galícía, de distribuïdors comercials; Spisula solidisima i Loligo pealeii (calamar) varen ser obtinguts de Woods Hole. Octopus vulgaris (pop) es va obtenir a Banyuls, França i Eledone cirrhosa (pop blanc) es va obtenir dels pescadors del port de Barcelona.
cada etapa del que s’obtenia en cada fracció, mitjançant tècniques d’electroforesi. Aquesta gradació de medis àcids va permetre la separació de les proteïnes semblants a histones i les proteïnes bàsiques.305 Les fraccions obtingudes es van analitzar
mitjançant espectrofotometria. Això va cobrir la primera etapa del treball, consistent en la obtenció de les diferents fraccions proteiques. Per procedir a l’anàlisi dels aminoàcids, es van hidrolitzar mostres de les diverses proteïnes i la seva composició d’aminoàcids va ser determinada mitjançant un analitzador automàtic.306
Un aspecte important a destacar en l’apartat de les tècniques va ser el desenvolupament d’una microtècnica d’electroforesi que es va fer servir en casos en que es disposava de poca quantitat de mostra. Aquesta tècnica va ser desenvolupada per l’enginyer Joaquim Lloveras, de qui es parlarà detalladament més endavant, i consistia en fer un gel de poliacrilamida dins d'un capil·lar.
Per a aquest treball, Lloveras també va desenvolupar una tècnica d’electroforesi preparativa, consistent en successives electroforesis que van permetre separar els diferents components per tal de procedir al seu posterior estudi mitjançant l’analitzador d’aminoàcids. La tècnica consistia en separar els components mitjançant una electroforesi sobre gel pla. Però en lloc de tenyir-ho tot, per veure'n les bandes separades, es tallaven els extrems d’aquest gel i es tenyien. La part central del gel era on es trobava la major part dels components de les proteïnes ja separades.307
Els resultats van permetre conèixer els diferents tipus de proteïnes bàsiques presents als espermatozous dels mol·luscs. Però encara s’havia de completar la caracterització de les proteïnes presents a cada espècie, especialment en el cas dels cefalòpodes. En moltes d’elles, proteïnes idèntiques o, com a mínim semblants a les histones, eren presents als espermatozous juntament amb més proteïnes bàsiques.308
305 La designació de “histone-like”, es dona a aquelles proteïnes que mostren una mobilitat
electroforètrica similar a la de les histones somàtiques. En tots els casos en que la composició en aa ha estat determinada, la seva semblança ha estat confirmada.
306 Espectrofotòmetre Beckman DB-GT i un analitzador automàtic d’aminoàcids Beckman
Unichrom. La compra de l’analitzador d’aminoàcids va ser possible gràcies a un ajut del Fondo Nacional para el Desarrollo de la Investigación Científica (FNDIC). Entrevista de l’autor amb Joan Antoni Subirana a l’autor, 21 de novembre de 2002.
307 Entrevista amb Joaquim Lloveras, 13 de febrer de 2003.