Histones: un objecte material de recerca
5.5. Un projecte de recerca en histones a Barcelona
5.5.1. L’elecció dels materials d’estudi i els inicis de la recerca
La lectura de treballs de Maurice Wilkins de 1956 en esperma de salmó i de sípia, i els de R i E. Vendrelly de 1960 en equinoderms els van fer dirigir-se a l’estudi d’aquests organismes.260 Els precedents d’aquests són un treball de Wilkins de 1951
en el qual, mitjançant tècniques de difracció de RX, s’havien observat algunes
258 A data de presentació del projecte de Palau i Subirana, estudis d’aquests tipus havien
presentat dificultats perquè totes les fraccions que es coneixien consistien en diverses espècies moleculars. Només les fraccions F2b i F2a2 de timus de vedella havien estat raonablement purificades.
259 Per detalls al voltant dels procediments tècnics proposats, vegeu la pàgina 4 del projecte
presentat als NIH.
260 Entrevista de l’autor amb Joan Antoni Subirana, 19-02-03. El treball dels Vendrelly és:
”Données biochimiques récentes sur la relation entre Acid Désoxyribonucléique et protéines basiques dans le noyau” Biochemical Pharmacology, 1960, vol 4, pp.19-28, citat a SUBIRANA, COZCOLLUELA, PALAU & UNZETA (1973). Vegeu també OLBY (1994).
semblances entre l’estructura del virus del mosaic del tabac cristal·litzat, els cromosomes espiralats i la forma helicoide d’alguns caps d’espermatozous.261
Quasi tots els animals tenien unes proteïnes nuclears diferents en els seus espermatozous, protamines en lloc de histones, però els equinoderms i altres grups d’animals tenien histones, és a dir, les mateixes que hi havia al nucli somàtic, si bé amb petites diferències. Un altre avantatge era la simplicitat de l’organisme escollit, així com la seva disponibilitat, ja fos al Instituto de Investigaciones Pesqueras del CSIC a Barcelona, als mercats de la ciutat, al Port de Barcelona o pescant-los a la Costa Brava.262
Aquesta simplicitat facilitava el seu estudi: disposar de cèl·lules que continguessin els mínims components possibles i, entre ells, les proteïnes desitjades. Com que al nucli d’un espermatozou només hi havia DNA i histones, això els va convertir en organismes model en permetre extrapolar a altres, segons Subirana, els resultats obtinguts.263 L’eriçó de mar, per la seva banda, era un sistema experimental
d’ús comú en biologia. Els seus ous, amb una llarga història dins de l’embriologia experimental, eren un material molt pràctic que podia ser obtingut en grans quantitats, es desenvolupava amb gran sincronia i era raonablement permeable a precursors marcats (Gross et al., 1964).
Mentre Palau era a Londres i Subirana estava pendent de marxar a Houston, el projecte de les histones d’equinoderms prenia forma:
“Creo que el trabajo con las histonas de la esperma de equinodermos deberá estructurarse así:
- Obtener aa [aminoàcids] de histonas totales y sus electroforesis.
261 Treballs importants en cristal·lografia del TMV varen ser fets per Rosalind Franklin a partir de
1953, un cop havia deixat el King’s per traslladar-se al Birkbeck College de Londres, amb Bernal. No va ser fins la dècada dels anys 1970s que van aparèixer uns pocs treballs limitats a l’estudi de protamines de peixos (OLBY, 1994). Es prestava, doncs, poca atenció a altres espècies que mostraven diferències considerables tant en grandària com en la seva composició en aminoàcids (SUBIRANA, COZCOLLUELA, PALAU & UNZETA, 1973; SUAU i SUBIRANA, 1977). Si bé es va començar amb l’estudi d’eriçons i holotúries, després es va ampliar als mol·luscs.
262 Vegeu SUBIRANA, COZCOLLUELA, PALAU & UNZETA (1973). Entrevista de l’autor amb Joan
Antoni Subirana, 11-11-02.
- Si son iguales hacer cromatografías de columna para aislar una de ellas, Arbacia sería la mejor seguramente, y analizar cada fracción a fondo. Hacer lo mismo con Mytilus, que es distinto.
- La ventaja de Mytilus y Arbacia es que nos será fácil obtener posteriormente embriones y tejido adulto y comparar con las histonas de éstos.
Los protozoos, creo que debemos dejarlos mientras no tengamos más colaboración, aunque no debemos perder el contacto con el problema”. 264
Un problema tècnic que els preocupava era com poder fer cultius cel·lulars de protozous que els permetessin obtenir DNA en quantitats suficients i era per aquest motiu que Subirana proposava posposar-ho i concentrar-se en la separació i caracterització de les diverses fraccions d’organismes diferents. 265
Des de Londres, Palau expressava la seva preocupació per la possibilitat de
overlapping amb altres grups i per la incertesa citològica de si hi havia o no histones als organismes estudiats. Per Subirana, la qüestió del overlapping era prematura. Sobre la segona,
“En otra carta me hablas de evidencia citológica de si hay o no histonas. La verdad es que las pruebas citológicas son muy aleatorias y se han de mirar con mucha reserva, pues las tinciones se aplican a complejos de macromoléculas y es casi seguro que las histonas tiñen o no según sus acompañantes”. 266
Calia veure si hi havia diferències entre les histones dels eriçons, les estrelles de mar i les holotúries i també es van plantejar diferents mètodes de separació del
264 JAS a JP, Barcelona, 25-8-65. Mytilus edulis és el musclo comú, i es localitza a les costes
catalanes. Arbacia lixula és l’eriçó de mar ja esmentat.
265 Hi havia un grup a al Departament de Química de la Universitat de Birmingham que s’hi
dedicaven i que havien publicat un treball al J. Protozool. l’any 1963, i potser seria interessant que Palau els fes una visita per saber quin instrumental caldria per fer cultius de 50 a 100 litres de protozous “con todos los truquitos que puedas averiguar. Esto no es urgente, pero hazlo a la primera ocasión que se te presente”. Vegeu JAS a JP, Barcelona, 8-5-65, 15-5-65.
266 JAS a JP, Barcelona, 25-8-65. Sobre citoquímica de histones, vegeu SWIFT (1964) a BONNER &
DNA i les histones.267 La tasca de Subirana a Barcelona va ser la d’aïllar les histones
d’esperma de musclo, així com en l’extracció de histones d’equinoderms com Arbacia
(eriçó) i Holothuria (cogombre de mar):
“Lo que he aislado son las histonas de la esperma del mejillón (Mytilus edulis), pariente algo próximo del calamar (Loligo), descrito por Hamer. Te mandaré esto dentro de un par de días. Creo que en el primer paso interesa obtener histonas totales, por lo que no he aplicado el metodo de Johns (....) La esperma de mejillón es un material muy bueno para aislar flagelos puros, por lo que quizás valdria la pena hacerlo en relación con el tema de la mitosis. Ponte al corriente de lo que hace el grupo de Randall, Huxley etc. en el King’s College sobre movilidad en general”.268
El 25 d’agost de 1965, Subirana va comunicar a Palau que, cap a finals d’estiu marxaria cap els EUA, a Houston, per a donar un curs de polímers i el curs de bioquímica de Joan Oró, en qualitat de professor associat.269 L‘estada a Houston
consistia en donar les classes d’Oró i preparar les oposicions a càtedra a l’Escola d’Enginyers. Però al mateix temps, el treball en histones seguia present en la seva correspondència amb Palau, a rel dels seus contactes amb el grup de Lubomir Hnilica, del departament de bioquímica de la mateixa universitat:270
267 JAS a JP, camí de Houston, 17-9-65; JAS a JP, Houston, 23-10-65.
268 JAS a JP, Barcelona, 2-6-65. Vegeu aquesta carta per detalls més concrets sobre tècniques.
Cal recordar que els mètodes de Johns permetien obtenir separadament les diferents fraccions històniques, que no era l’objestiu de Subirana i Palau en aquells instants. Per altra banda, D. Hamer va descriure un procediment d’obtenció de histones de calamar, Loligo, l’any 1955, al Biol. Bull., 108, 35. El grup de John Randall al King’s College havia treballat des de 1964 estudiant l’aparell flagel·lar com a orgànul model per a l’estudi del creixement i la morfopoièsi. Es pretenia entendre aquests dos aspectes del desenvolupament en termes físico-químics, considerant la seva utilitat en l’estudi de sistemes biològics complexos, en contraposició a visions més reduccionistes, com ara els treballs en bacteriòfags. Vegeu RANDALL (1969). Per més detalls de Randall, vegeu WILKINS (1987) i DE CHADAREVIAN (2002).
269 1965-66, segons consta al seu CV.
270 Hnilica i el seu grup varen contribuir a la obtenció de les cinc fraccions històniques al mateix
temps que Johns. Varen col·laborar en el volum de revisió de Phillips de 1971. La seva contribució va consistir en la revisó de la biosíntesi de histones i el cicle cel·lular. Vegeu HNILICA et al. (1971).
“Por aquí voy manteniendo contacto con los histónicos y creo que podemos hacer algo interesante. No se si te habrás fijado que las histonas de Astropecten tienen la misma composición que las del timo. Imagino que las de erizo serán también semejantes, no tengo aquí los datos. Su estudio es muy interesante pues en el microscopio electrónico se ve que esta esperma está ordenada en fibras de 100 Ansgtroms de diámetro, mientras que en las de tipo protamina son fibras de 40 Ansgtroms, incluyendo los cefalópos (calamar) que tienen composición intermedia y que será interesante estudiar en una segunda etapa, así como el mejillón que también era distinto, pero no se como aparece en el microscopio electrónico. Será interesante buscarlo y podría ser un tema de tesis para biólogo (....) Una de las cosas que me animan de este tipo de investigación es que, exceptuando los análisis de aminoácidos, no se necesitan muchos fondos para hacer marchar el trabajo y es posible que podamos hacer cosas interesantes”.271
“Desde luego, si Hnilica se dedica a las [histonas] del erizo, es una tontería competir, pero la impresión que me dió hace unas semanas es que habían obtenido algunas fracciones pero sin prestarle demasiada atención -> me enseñó todos los aa-análisis que había hecho y demás.(....) Creo que ahora lo más interesante sería ver si las fracciones del erizo (o de Astropecten) son iguales a las de timo. Tercer paso ver cómo son las proteínas nucleares de embriones y tejido adulto”.272
El fil conductor de la seva recerca en histones, mitjançant els organismes escollits com a objectes d’estudi, era el d’estudiar la seva semblança al llarg de la escala evolutiva, per tal d’intentar explicar la seva funció en l’estructura del cromosoma. En aquells moments es suposava que les histones s’unien a regions del DNA ben definides i també hi havia dades que suggerien que ho farien mitjançant unions electrostàtiques. Les dades s’havien obtingut d’estudis d’interaccions entre el DNA i les histones, tant en complexos naturals com artificials, i era d’interès era examinar la seva reversibilitat per a esbrinar si aquestes eren específiques en algun aspecte, qüestió que formava part dels objectius a llarg termini del projecte presentat als NIH. Subirana va suggerir treballar-hi ies va procedir començant pels estudis de
271 JAS a JP, Houston, 8-12-65. Els histònics de Houston són el grup de Hnilica. 272 JAS a JP, Houston, 7-1-66.
caracterització d’aquestes proteïnes. Posteriorment en el temps es va iniciar el treball en DNA. 273