Estudio histológico descriptivo del callo

Se determinó para cada zona una serie de aspectos histológicos relevantes (Tabla 8). Se llevó a cabo una determinación en cada zona del número de osteoblastos y osteoclastos por 10 campos de HPF (a 40x). Así como una determinación en cada zona del número de luces vasculares por 10 campos de HPF (a 40x). Se determinó la presencia de tejido fibroso y la de cartílago en cada zona (0: ausencia, 1: presencia). Se determinó la presencia de trabéculas en cada zona del callo (0:ausencia, 1: presencia, 2: abundancia). Se determinó el tipo de osificación predominante para todo el callo en conjunto (Z1, 2 y 3) : endocondral (1), intramembranosa (2), o mixta (3).

Variables cuantitativas Variables categóricas

Nº de osteoblastos por 10 campos por zona (Z1, 2 y 3)

Nº de osteoclastos por 10 campos por zona (Z1, 2 y 3)

Nº de luces vasculares por 10 campos por zona (Z1, 2 y 3)

Tejido fibroso por zona (Z1,2 y3) (0: ausencia, 1:presencia)

Tejido cartilaginoso por zona (Z1,2 y3) (0:ausencia, 1: presencia)

Presencia de trabéculas por zona (Z1,2 y 3) (0:ausencia, 1: presencia, 2: abundancia)

Tipo de osificación global (1: endocondral, 2:intramembranosa, 3: mixta)

Tabla 8. Variables analizadas en el estudio histológico descriptivo del callo.

4.4.2. Estudio histológico de la madurez del callo

Para estudiar la madurez del callo de elongación primero se analizó la presencia de trabéculas óseas en cada zona y su grado de maduración, así como el osteoide y su volumen relativo respecto al hueso mineralizado. También se evaluó el paso de trabéculas en la zona 3, concepto denominado bridging, aspecto que traduce una maduración del regenerado al ir desapareciendo la zona de mineralización. Posteriormente se evaluó la maduración del regenerado por zonas y en conjunto.

Mediante el microscopio de luz polarizada se observó si había trabéculas óseas o hueso lamelar maduro en cada zona, lo cual era esencial para determinar el grado de maduración del fenómeno regenerativo. Determinándose las siguientes posibilidades: ausencia de trabéculas (0), presencia de trabéculas óseas compuestas por hueso fibroreticular inmaduro que no muestran birrefringencia en el microscopio de luz

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polarizada (1), y presencia de trabéculas óseas con tejido óseo lamelar con birrefringencia positiva en luz polarizada (2).

El paso de trabéculas por la zona 3, o bridging, se determinó en escala ordinal como ausencia de puentes óseos (0), incompleto (1), y completo (2).

Se calculó el Volumen Relativo de Osteoide (ROV) para cada zona. Para ello se empleó la tinción de Tricrómico de Masson, que tiñe de azul oscuro el osteoide y deja en rojo el hueso mineralizado, y se calculó con el microscopio con retícula de 100 puntos el número de puntos ocupados por osteoide y el número de puntos ocupados por tejido mineralizado y osteoide. El Volumen Relativo de Osteoide (ROV) se expresa en porcentaje.

Se determinó la fase de maduración de cada zona, determinando si se encontraba en equivalencia con la zona central de crecimiento (0), si equivalía a una zona de mineralización (1), a una zona de remodelación (2), o a una de tubulización (3). Ésta última consiste en la formación de hueso cortical y medular, y supone la fase última de la regeneración ósea.

La maduración del callo de elongación en conjunto se llevó a cabo por dos métodos. El primero fue mediante estimación de los días de maduración convertidos a una escala ordinal. Los primeros 3 días se definen como la fase hemorrágica (0); del día 3 al 7 es la inflamatoria (1), en la que se encuentra tejido de granulación y osteoide inmaduro; del día 7 al 35 se suele observar presencia de tejido fibroso, hueso lamelar y formación de cartílago (2); a partir del día 35 el callo suele caracterizarse por la presencia de hueso lamelar y actividad osteoclástica de remodelación (3).

El otro método empleado para describir la maduración del callo en su conjunto es la descripción del estadio del regenerado, también convertido a escala ordinal. El estadio de hematoma se da en las primeras horas y días (0); el estadio inflamatorio es a partir de las 48 horas (1); en el estadio de granulación se observan fibroblastos, capilares y células mesenquimales, se describe del día 3 al 12 (2); el estadio de callo blando destaca por el comienzo de formación de cartílago y trabéculas inmaduras (3); el estadio de callo duro presenta trabéculas maduras y puentes óseos que cruzan el foco (4); el estadio de remodelación presenta una sustitución del hueso fibroreticular por hueso lamelar y cortical, así como una tubulización y formación de endostio (5).

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Las variables empleadas en el estudio de maduración se encuentran reflejadas en la Tabla 9. Las variables cuantitativas del estudio histológico fueron estudiadas mediante T de Fisher. Las variables dicotómias mediante Chi-Cuadrado y las ordinales mediante el test no paramétrico U de Mann-Whitney.

Variables cuantitativas Variables categóricas

Volumen Relativo de Osteoide (ROV) por zona (Z1,2 y3) (%)

Madurez trabecular por zona (Z1, 2 y 3) (0: ausencia; 1:inmaduras; 2: lamelar)

Paso de trabéculas por zona 3 (0:ausencia; 1:incompleta; 2:completa)

Maduración por zona (Z1,2 y3) (0:zona central de crecimiento; 1:zona de mineralización; 2:zona de remodelación; 3:zona de tubulización)

Maduración del callo en días (0: <3d; 1: 3-7d; 2: 7-35d; 3: >35d)

Maduración del callo en estadios (0:hematoma; 1:inflamatorio; 2:granulación; 3:callo blando; 4:callo duro; 5:remodelación)

Tabla 9. Variables analizadas en el estudio histológico de la madurez del callo.

4. 5. Histomorfometría

El estudio histomorfométrico permite cuantificar aspectos relevantes de la estructura y actividad de un tejido. En nuestro estudio la histomorfometría está orientada a la determinación de la proporción de los principales tejidos presentes durante la osteogénesis a distracción. No se han incluido en el estudio histomorfométrico ni la cuantificación de células ni de luces vasculares, ya que el propio estudio histológico simple lo incluye. Tampoco se ha calculado ningún índice de madurez del regenerado ni de la madurez trabecular, puesto que también se ha realizado a partir de la histología simple.

Mediante el sistema ImajeJ! se ha determinado la superficie relativa cubierta de tejido óseo, de cartílago y de tejido fibroso. Para ello se ha llevado a cabo una determinación de la superficie total de cada regenerado para posteriormente sustraer el espacio intertrabecular ocupado o por grasa o por médula ósea. A partir de esta determinación, tomada como el 100% del regenerado se han ido determinando la superficie relativa de cada tejido. Mediante la tinción de Hematoxilina-Eosina se calculaba la superficie relativa de tejido óseo tras aplicar el protocolo de análisis de imágenes digitalizadas. Para el cálculo de la superficie relativa de cartílago y tejido fibroso se empleaba la tinción de Tricrómico de Masson, siguiendo un protocolo específico para

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cada tejido basado en la distinta tinción de cada uno. En la Tabla 10 se encuentran las variables estudiadas por la histomorfometría en este trabajo.

Variables cuantitativas

Superficie relativa de tejido óseo (%) Superficie relativa de cartílago (%) Superficie relativa de tejido fibroso (%)

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1. CONFIGURACIÓN DE LOS GRUPOS