Estudios Funcionales

5.1 Protocolo Básico: Determinación de la actividad citotóxica de las células T

La caracterización de la especificidad de las células T se realizó mediante ensayos de citotoxicidad. La citotoxicidad fue testada contra diferentes células diana usando un protocolo standard de 4 horas de liberación de 51_{Cr (}51_{Cr in saline, 1mCi/ml, Amersham Biosciencies,} Buckinghamshire, UK).

Los enterocitos, células foliculares tiroideas (CFT) y líneas adherentes fueron marcadas en cultivo 16 hs con 100 µCi de 51_{Cr en 3 ml de RPMI + 50% de SFB, mientras que las células no} adherentes, con 50 µCi51_{Cr a 37 ºC y 5 % de CO}

2durante 1h. La cantidad de células diana varió entre las 1000 y 5000 células por pocillo. Las células efectoras se sembraron a distintas relacio- nes dependiendo el ensayo. Los cultivos se realizaron en RPMI + 5% de SFB por duplicado en placas de 96 fondo en fondo V (Nunc). La liberación máxima de Cr se hizo en presencia de Tritón 2% (50ul células diana + 100 ul de Tritón 2%) y la espontánea en presencia de RPMI , ambos por triplicado. Al cabo de 4 hs las placas se centrifugaron 3 min a 170 x g (900 RPM , centrífuga MinifugeT, Heraeus, GmbH HerausstraBe 12-14, Hanau, Alemania) durante 3 min. El51_{Cr libera-} do se midió en un contador de centelleo Microbeta (1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter, Wallac Oy, Turku, Finlandia).

El porcentage de lisis se calculó siguiendo la fórmula standard: (lisis célula diana - lisis espon- tánea) / (lisis máxima - espontánea) x100.

5.1.1 Protocolo alternativo: Inhibición de la citotoxicidad

Para los ensayos de inhibición se incubaron las células efectoras o dianas con los AcMo a concentraciones saturantes durante 30 min a 4ºC, antes de mezclar las células. La inhibición representa la diferencia entre el porcentaje de lisis sin Ac menos el porcentaje obtenido con el Ac. El porcentaje de inhibición se calculó mediante la siguiente fórmula: [1- (% lisis en presencia de mAb/% lisis en ausencia de mAb)] x100 ].

72 Métodos

5.1.2 Protocolo alternativo: Inhibición de la lisis por células frías

La células efectoras y dianas (calientes) se ajustan a la relación deseada (pe; E:T=10:1). Las dianas frías se agregan en el cultivo a una relación diana fría: caliente de 16:1, 4:1 y 1:1. El porcentaje de lisis se calculó según la fórmula: [1- (% lisis en presencia de células frías/% lisis en ausencia de células frías)] x 100.

5.1.3 Protocolo alternativo: Inhibición de la exocitosis de los gránulos de perforina e inhibi- ción de la via de las caspasas

Para la inhibición de la lisis mediada por gránulos de Perforina, las células T se preincubaron durante 2 h a 37 ºC con 10-1000 ug/ml de Concamycina A (CMA, Sigma-Aldrich). Durante el ensayo de 4 h de liberación de51Cr la droga permanece en el cultivo (205). Para la inhibición de la lisis inducida por FASL, se añadió a la placa de citotoxicidad 20-50 uM de ZVAD-FMK (Sigma- Aldrich). El ZVAD-FMK es un inhibidor de la via de las caspasas.

5.1.4 Protocolo alternativo: Lisis redirigida sobre la línea P815

Se denomina lisis redirigida ya que la interacción entre el receptor de la célula efectora con la célula diana está favorecida por un Ac. Este Ac se une a la célula diana a través de un receptor Fc (Fragmento Constante de las Ig´s) y a la célula efectora por su región variable. Como diana celular se utilizó la línea P815. Una vez marcada con51_{Cr las células se sembraron a razón de} 1000/5000 células/pocillo y se incubaron con el Ac a distintas diluciones. La relación efectora : diana, permaneció constante.

5.2 Protocolo Básico: Proliferación de linfocitos T

Las células (PBL CD8+ y células T γδ-clon EC9.90) fueron estimuladas con Ac´s anti-CD3 (OKT3) con y sin Ac´s anti-CD28 (158-2E10), NKG2D (1D11) or CD2 (204-12) en placas de 96 fondo plano (Nunc) previamente tratadas con Ac´s de cabra anti - cadena γ de ratón (Ver más adelante; apartado 5.3.2). Las células se incubaron a 5x104_{células/pocillo en 100 ul de volumen} final. Al cabo de 72 hs se agregó 1µCi Thymidine ([methyl-3_{H] a 1mCi/ml en solución acuosa,} Amersham Biosciencies). Luego de 18 hs se transfirió el cultivo en membranas de fibra de vidrio FilterMat (Skatron, Lier, Noruega) y la cantidad de isótopo incorporado se determinó en un conta- dor Microbeta (1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter, Wallac Oy, Turku, Finlandia)

5.3 Protocolo Básico: Determinación de Citoquinas por Citometría (CBA-Cytometry Bead Array)

La determinación y cuantificación de citoquinas en el sobrenadante se realizó por citometría de flujo mediante CBA (Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array Kit (CBA, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Este sistema permite cuantificar en una sóla muestra los niveles de Interleuquina-2 (IL-2), Interleuquina-4 (IL-4), Interleuquina-5 (IL-5), Interleuquina-10 (IL-10), Fac- tor de Necrosis Tumoralα(TNF-α) e Interferon-γ(IFN-γ) por citometría de flujo (206), a partir de

standares de concentración conocidos.

25 ul de cada sobrenadante (previamente diluido 1/20 en tampón de muestra) se mezclaron con igual volumen de los Ac asociados a las bolas (Beads) y con 25 ul del reactivo de detección (Ac- PE específico para cada citoquina). La mezcla se incubó durante 3 hs a Tº ambiente. La adquisi- ción de los datos se realizó usando un citómetro de flujo FACscan®_{y posteriormente analizados} con el programa informático BD Cytometric Bead Array (CBA).

5.3.1 Protocolo alternativo: ELISA (Enzyme Linked Immuno-abSorbent Assay)

Algunas muestras se analizaron para IL-4 e IFN-γpor ELISA siguiendo los protocolos reco- mendados por el fabricante (Diaclone Research, Besançon, France). La absorbancia a 450 nm se midió en un espectrofotómetro (Biochem Immunosystems ELISA reader, Casalecchio di Reno, Italy).

5.3.2 Protocolo asociado: Estimulación de células T para la producción de citoquinas

Para los ensayos de producción de citoquinas, las células T (5x104_{) se estimularon con dife-} rentes combinaciones de anticuerpos en placas de 96 pocillos fondo plano (Nunc). Las placas se preincubaron con Ac de cabra anti - cadena γ de ratón (goat anti-mouse γ chain (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama). La adsorción del Ac a la placa se realizó incu- bando en cada pocillo 3 ug de este en 30 ul de PBS durante 90 min en incubador a 37 ºC. El exceso de anticuerpo se lavó tres veces con PBS y una con RPMI. Posteriormente se agregaron las células y los Ac´s en un volumen final de 100 ul. Cada combinación se realizó por duplicado. Los sobrenadantes se recogieron luego de 24 y 48 hs.

5.4 Protocolo Básico: Citoadherencia de Linfocitos T sobre secciones de epitelio intestinal

Para la citoadherencia de células T se utilizaron tejidos de yeyuno obtenidos de pacientes sometidos a gastroplastia (Dr. Alastrue) o de biopsias intestinales de pacientes celíacos (Gastrología Hospital San Joan de Deu y Can Ruti ). Estos se incluyeron en Bright-Cryo-M-Bed (Cambs, PE29 6EU, Reino Unido) y congelaron en N₂líquido usando una interfase de isopentano. Secciones de criostato de 4-5 micrones se montaron en portaobjetos y se deshidrataron a Tº ambiente durante toda la noche. Los cortes envueltos en film plástico se guardaron a –20 ºC hasta su uso.

Las células T se incubaron con AcMo anti-HLA clase-I (W6/32) durante 1 hr a 4ºC. Luego de lavar el Ac, se incubaron las células sobre cortes de Tejido durante 1 hr a 4ºC. Luego de lavar las células con PBS, se fijaron en paraformaldheido 4% durante 5 min, y se inhibió la peroxidasa endógena con 3% H₂O₂durante 30 min a T amb. Posteriormente se lavó en PBS y se incubó con un Ac biotinilado de cabra anti – ratón dilución 1/100 (Southern) durante 30-30 min a 4 ºC. Luego de lavar con PBS, se incubó con streptavidina-HRP (Horseradish-Peroxidase-Streptavidin, ATOM) a una concentración final de 5µg/ml durante 30 min a Tº ambiente. Posteriormente se lavó con PBS y reveló con DAB (3,3-Diamino.Benzidine-4HCL, SERVA, Heidelberg, Alemania) en una solución de PBS (50 mg DAB, 200 ml PBS, 200 ul H₂O₂) durante aproximadamente 5 min hasta

74 Métodos

la aparición de color. Los preparados fueron contrastados con Hematoxilina-Eosina, montados en DPX y observados al microscopio.

La fotografía se realizó con el sistema confocal utilizando un Microscopio óptico de fluorescencia Zeiss Axioskop 2 ( Zeiss, Alemania). Las imagenes se capturaron con una Cámara color Hamamatsu C5810 y analizaron mediante el sistema de tratamiento digital de imágenes Openlab (Improvision Ltd. Inglaterra) en Apple Macintosh G3 y G4 utilizando deconvolución digital, morfometría y re- construcción 3D.

5.4.1 Protocolo asociado: Tinción Hematoxilina-Eosina

Los cortes se tiñeron con heatoxilina – eosina de la siguiente manera: Sucesivamente se incu- baron 2 min con hematoxilina, lavan con H₂O del grifo, incuban con Eosina 30 seg. Luego se deshidrataron 10 seg con EtOH 70%, 10 seg con EtOH 95%, 2 min EtOH 100%, 1 min con Xilol. Los cortes se montaron en DPX.