Estudios proteómicos previos en mitocondria

Tal como se introdujo anteriormente, la mitocondria se encuentra en una encrucijada metabólica por lo que comprender su funcionamiento bajo situaciones fisiológicas y patológicas siempre ha sido siempre de interés para la comunidad científica. Con frecuencia, los métodos elegidos para abordar estas cuestiones han sido la evaluación directa de la capacidad funcional y respiratoria de estos orgánulos en distintos tejidos y situaciones, lo que llevó a concluir que la actividad mitocondrial es bastante tejido-específica (Koliaki & Roden, 2016). Con la llegada de las técnicas proteómicas de alta resolución y la posibilidad relativamente sencilla de obtener mitocondrias aisladas mediante protocolos de centrifugación diferencial, los investigadores tuvieron a su disposición una serie ventajas que permitió, entre otras, descifrar el proteoma mitocondrial de los mamíferos (Calvo et al, 2016; Pagliarini et al, 2008).

En el contexto de la obesidad y la DM2, la mitocondria ha sido ampliamente explorada en tejidos insulino-dependientes como el hígado y el músculo esquelético, principalmente en modelos animales (revisado en (Peinado et al, 2014)). En relación al tejido adiposo, cabe destacar el estudio de Forner y col. en el que se analizaron comparativamente las mitocondrias aisladas a partir de tejido adiposo blanco y marrón, destacando la función anabólica y detoxificadora de la grasa blanca (Forner et al, 2009). También destaca el estudio de Newton y col. que describió las variaciones del proteoma mitocondrial durante el proceso de diferenciación de adipocitos (Newton et al, 2011). En el contexto del envejecimiento, la mayoría de los estudios del proteoma mitocondrial se han centrado en modelos de neurodegeneración animal (revisado en (Butterfield et al, 2016; Ingram & Chakrabarti, 2016)), destacando en este caso el interés por la aplicación de proteómica redox (Perluigi et al, 2014).

Como puede intuirse en las líneas anteriores, en general apenas existen estudios que hayan analizado el proteoma mitocondrial humano de forma directa. El primer tejido del que se aislaron mitocondrias para estudiar su proteoma fue la placenta (Rabilloud et al, 1998) y después le siguieron el músculo esquelético y cardíaco (Goudarzi et al, 2011; Lefort et al, 2009; Taylor et al, 2003) y algunos modelos celulares (Dai et al, 2010). Al comienzo de esta Tesis Doctoral existía un gran vacío referente al proteoma mitocondrial en tejido adiposo humano, motivo por el que se decidió realizar un análisis detallado de sus modificaciones con el envejecimiento y la DM2 en adipocitos, su principal componente (Gomez-Serrano et al, 2017). No obstante, es preciso destacar que durante el desarrollo de nuestro trabajo se publicó un estudio del proteoma mitocondrial de adipocitos humanos (Lindinger et al, 2015), aunque la resolución y el alcance de sus conclusiones fue bastante limitado.

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objetivos.

“Todo investigador tiene algún plan. Aspira a descubrir algo, y tiene ideas sobre cómo intentar llegar a ello, y sobre cómo es probable –a veces simplemente posible– que surja un camino viable. Pero en una carrera de investigación pura, el resultado de mañana puede hacer abandonar el plan de hoy.

No se puede fijar un itinerario en un terreno inexplorado”

61 Hasta la fecha, los estudios proteómicos que han utilizado muestras de tejido adiposo humano son relativamente escasos y el espectro de proteínas cuantificadas muy reducido. La aplicación de técnicas proteómicas de alta resolución al estudio de la obesidad ha quedado restringida a modelos animales, centrándose principalmente en otros tejidos insulino-dependientes como el músculo o el hígado. El avance de estas metodologías ha conseguido abarcar el estudio de proteomas completos, lo cual posibilita la aplicación de herramientas de Biología de Sistemas. Por estos motivos, en el presente Trabajo de Tesis Doctoral se plantearon los siguientes objetivos:

1. Aplicación de la metodología iTRAQ-LC/MS para el análisis cuantitativo del proteoma del VAT en el contexto fisiopatológico de la obesidad

2. Estudio de los cambios proteómicos del VAT asociados al envejecimiento en obesidad sin enfermedad metabólica

3. Estudio de los cambios proteómicos del VAT asociados al desarrollo de DM2 en obesidad

4. Estudio de los cambios proteómicos del VAT en obesos diabéticos de distinto género

A la vista de los resultados obtenidos en los estudios de envejecimiento y DM2, el análisis exhaustivo de la mitocondria ofrecía nuevas posibilidades para entender el papel de la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo en la fisiopatología de la obesidad. Además, en el momento de plantearnos este trabajo no existían referencias en la literatura que hubieran abordado ni el proteoma mitocondrial de adipocitos humanos ni sus modificaciones oxidativas a gran escala. Por ello, se plantearon también los siguientes objetivos:

5. Aplicación de la metodología iTRAQ-LC/MS para el análisis cuantitativo del proteoma y del redoxoma tiólico mitocondrial de adipocitos humanos aislados

6. Estudio de los cambios en el proteoma y redoxoma tiólico mitocondrial asociados al envejecimiento en obesidad sin enfermedad metabólica

7. Estudio de los cambios en el proteoma y redoxoma tiólico mitocondrial asociados al desarrollo de DM2 en obesidad

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materiales y

métodos.

“La práctica es un maestro excepcional.”

65 1. DECLARACIONES ÉTICAS

Los estudios realizados en esta Tesis Doctoral se han llevado a cabo bajo las recomendaciones éticas recogidas en la Declaración de Helsinki (1967) y con respeto a la Ley de Investigación Biomédica Española (Ley 14/2007). Los proyectos de investigación involucrados fueron aprobados por los Comités Éticos de los Hospitales Clínico San Carlos (14/441-E, 2014) y Gregorio Marañón (obesCSIC001, 2012; Proteo_Adi 148/16, 2016) de Madrid (España). Todos los pacientes fueron informados de la finalidad de la investigación y dieron su consentimiento previo a la participación.

Este trabajo ha sido elaborado bajo las pautas, principios y compromisos recogidos por el Código de Buenas Prácticas del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).