Identificación del proteoma mitocondrial de los adipocitos humanos

Para el estudio proteómico mitocondrial, se utilizaron las muestras de adipocitos aislados procedentes de los grupos de mujeres obesas no diabéticas menores de 35 años (n=4), obesas no diabéticas mayores de 45 años (n=4) y obesas diabéticas mayores de 45 años (n=4) (Figura 7, Tabla 3). A partir de esos adipocitos, se aislaron las mitocondrias y se procesaron como se describe en los Materiales y Métodos (secciones 2 y 5, Figura 10). A partir de los extractos procedentes de las mitocondrias aisladas de las 12 pacientes implicadas, los análisis de HPLC-MS identificaron 27 578 péptidos bajo una FDR 1% (Tabla S14) correspondientes a un total de 3 542 proteínas codificadas por 3 306 genes (Tabla S15).

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Figura 32 | Análisis por microscopía electrónica. Las muestras de mitocondrias obtenidas mediante la tecnología MACS fueron analizadas mediante microscopía electrónica de transmisión. Se comprobó la integridad de las membranas mitocondriales y el reconocimiento de la membrana externa por parte de las microbolas magnéticas anti-TOM22 (cabezas de flecha). Se observó la coexistencia de otros orgánulos vesiculares tales como lisosomas o restos de retículo endoplásmico. La figura muestra imágenes representativas de tres experimentos independientes. Figura tomada de (Gomez-Serrano et al, 2017).

Al comienzo de esta Tesis Doctoral, el compendio de anotaciones mitocondriales más conocido y exhaustivo era el Human MitoCarta (Pagliarini et al, 2008). Esta base de datos se actualizó en enero de 2016 y cuenta ya con un total de 1 158 proteínas anotadas, ofreciendo datos de expresión para 14 tejidos de ratón (Calvo et al, 2016). Nuestro análisis identificó 841 proteínas de las anotadas en el Human

MitoCarta v2.0, cubriendo más del 88% del proteoma mitocondrial determinado específicamente para

tejido adiposo (Calvo et al, 2016).

Antes de proceder al análisis cuantitativo, todas las proteínas no mitocondriales co-identificadas se excluyeron del análisis basándonos, en primer lugar, en la base de datos Human MitoCarta v2.0 así como en la anotación GO mitochondrion (GO:0005739). No obstante, a menudo las categorías funcionales reflejan anotaciones no experimentales basadas en predicciones in silico (Smith & Robinson, 2016). Por ello, en segundo lugar, realizamos una curación manual de todas las proteínas identificadas como potencialmente mitocondriales (n=1 098) basándonos en sus funciones canónicas (anotadas en UniProt, http://www.uniprot.org/) así como otras fuentes de evidencia como el Human Protein Atlas

(http://www.proteinatlas.org/) (Uhlen et al, 2015). Finalmente, el proteoma mitocondrial de los adipocitos

del VAT quedó conformado por un total de 706 proteínas bona fide (Figura 33A) que serían cuantificadas en una etapa posterior. Es preciso destacar que gran cantidad de las proteínas cuya anotación mitocondrial era equívoca pertenecían al metabolismo lipídico (como por ejemplo FASN). Esto tenía especial relevancia en nuestra muestra, ya que las proteínas del metabolismo de ácidos grasos y lípidos

125 poseen especial representación en el tejido adiposo (Gomez-Serrano et al, 2016; Kim et al, 2014; Perez- Perez et al, 2012a). En caso de no haber hecho este cribado, pequeñas diferencias en el grado de contaminación de la muestra mitocondrial en los distintos grupos hubieran acarreado grandes diferencias en la distribución normalizada de los datos que iban a compararse, comprometiendo la veracidad de los resultados.

Figura 33 | El proteoma mitocondrial de los adipocitos humanos. (A) Análisis de las proteínas identificadas mediante HPLC-MS. Todas las proteínas no mitocondriales se excluyeron. El listado inicial se filtró de acuerdo a las anotaciones contenidas en la base de datos de Human MitoCarta v2.0 y GO mitochondrion, y después se curaron manualmente. (B) Distribución relativa de las 706 proteínas bona fide en los principales compartimentos subcelulares de la mitocondria. (C) Análisis de enriquecimiento de los principales procesos biológicos. Las barras representan el –Log10(p), donde p se refiere al p valor obtenido para el enriquecimiento. Se muestran funciones

representativas. La Tabla S16 contiene el total categorías funcionales enriquecidas con p < 0,05. Paneles A y B tomados de (Gomez-Serrano et al, 2017).

La distribución del contenido proteico en los principales compartimentos del orgánulo confirmó que el proteoma definido era consistente (Figura 33B), de acuerdo a lo esperado (Alberts et al, 2002). Es importante resaltar que 12 de las 13 proteínas codificadas por ADNmt se detectaron pese a su fuerte carácter hidrofóbico (Tabla S15), lo que remarca la calidad del proceso de extracción de proteínas. Con el

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objetivo de conocer las funciones biológicas destacadas en las mitocondrias de los adipocitos, realizamos un análisis de enriquecimiento de las 706 proteínas mediante DAVID (Tabla S16). Los resultados mostraron que la fosforilación oxidativa y la síntesis de ATP destacaban frente al resto de funciones, aunque el metabolismo de diversos aminoácidos también contaba con una fuerte representación (Figura 33C). Otra de las funciones significativamente representada fue la elongación de ácidos grasos en la mitocondria, una ruta que se considera una reminiscencia del pasado procariota de este orgánulo (Autio et al, 2008; White et al, 2005). Esta ruta se ha estudiado especialmente en levaduras (Hiltunen et al, 2010), y aunque su funcionalidad sigue siendo un enigma, se ha comprobado que defectos en esta vía comprometen el metabolismo energético de la mitocondria (Hiltunen et al, 2009). Nuestro estudio identificó proteínas, como la trans-2-enoyl-CoA reductase (MERC), implicadas directamente en esta vía, lo que señala un posible papel regulador en el metabolismo de los adipocitos.

Hasta la fecha, son pocos los estudios que han abordado directamente el proteoma mitocondrial humano (Dai et al, 2010; Goudarzi et al, 2011; Lindinger et al, 2015; Rabilloud et al, 1998; Taylor et al, 2003). Sin embargo, durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se publicó el que estudiaba por primera vez el proteoma mitocondrial de los adipocitos viscerales humanos (Lindinger et al, 2015). La Tabla 13 resume los aspectos generales del trabajo citado y los compara con los llevados a cabo en la presente Tesis Doctoral (Gomez-Serrano et al, 2017). Lo más llamativo es el número de proteínas mitocondriales identificadas: en el caso de Lindinger y col. se encontraron 62 proteínas, mientras que en el trabajo aquí expuesto fueron 706. Además, la cuantificación y validación de los resultados de su investigación se llevó a cabo mediante métodos indirectos (Tabla 13). El número de proteínas identificado en nuestro estudio fue similar al encontrado por Goudarzi y col., que utilizaba extractos de mitocondria humana de corazón (Goudarzi et al, 2011), no obstante, estos autores no mencionaron ningún tipo de filtrado ni cribado, por lo que entre sus proteínas identificadas también se encuentran las de otros orgánulos.

A partir de los datos anteriormente expuestos, se puede concluir que nuestro estudio describió el proteoma humano mitocondrial más completo (n=706), a pesar de haber utilizado criterios rigurosos en la identificación de péptidos (FDR 1%) y de haber realizado un filtrado y curación manual de los datos. Por estas razones, creemos que destaca la significación de nuestros resultados, especialmente en el contexto del tejido adiposo y la obesidad.

2.3. Análisis de los cambios en la abundancia de proteínas: identificación de DAPs y cambios