Exopolisacárido (EPS)

Los EPS son polisacáridos extracelulares que se producen en grandes cantidades y se secretan al exterior celular. Pueden estar débilmente asociados a la superficie celular o dicha unión puede ser nula (Becker et al., 1998; Fraysse et al., 2003; Skorupska et al., 2006). Son homo- o heteropolímeros ácidos que suelen ser específicos de especie o de estirpe y están constituidos por unidades de repetición compuestas principalmente por monosacáridos comunes como D-glucosa, D-manosa, D-galactosa, L-ramnosa, y ácidos D-glucurónico y D-galacturónico (Figura 11). Además, estas unidades pueden estar decoradas con sustituciones de tipo acetilo, piruvilo, succinilo y metilo (Becker et al., 1998 Skorupska et al., 2006; Downie, 2010; Janczarek, 2011).

La mayoría de los EPS de los rizobios de crecimiento rápido suelen estar compuestos por entre ocho y nueve azúcares como ocurre en las especies de S. meliloti, S. fredii, R.

leguminosarum y R. tropici. El EPS puede producirse de dos formas diferentes, una de

bajo peso molecular (LMW; del inglés, Low Molecular Weight) constituida por monómeros, dímeros y trímeros de las subunidades de repetición, y una de alto peso molecular (HMW, High Molecular Weight) constituidos por polímeros de hasta 106_-107

Da (Fraysse et al., 2003; Janczarek et al., 2011). En el caso de los rizobios de crecimiento lento, las estructuras del EPS son muy diversas como por ejemplo en las especies de B.

japonicum y Bradyrhizobium elkani, compuestos por repeticiones de un pentasacárido

(Minamisawa, 1989; Poveda et al., 1997) y un tetrasacárido respectivamente (An et al., 1995).

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S. meliloti produce dos tipos de EPS, el succinoglucano (EPS I) y el galactoglucano (EPS

II), éste último sintetizado bajo condiciones limitantes de fosfato (Zhan et al., 1991; Reinhold et al., 1994; Zevenhuizen et al., 1997). El succinoglucano está constituido por unidades de repetición que contienen siete residuos de D-glucosa y un residuo de D- galactosa unidos por enlaces β-glucosídicos y con sustituciones de tipo acetilo, piruvilo y succinilo (Reuber et al., 1993; Reinhold et al., 1994; Zevenhuizen et al., 1997) (Figura 11). El galactoglucano está constituido por un disacárido compuesto por residuos de D- glucosa y D-galactosa unidos por enlaces α y β y con sustituciones de tipo acetilo y piruvilo (Her et al., 1990; Reuber et al., 1993; Zevenhuizen et al., 1997) (Figura 11). En el caso de las estirpes de R. leguminosarum, el EPS producido consta de una estructura básica, aunque puede variar en cuanto a las modificaciones de tipo no-carbohidratos. Su estructura está compuesta por unidades de repetición que contienen D-glucosa, D- ácido glucurónico y D-galactosa, además de modificaciones de tipo acetilo y piruvilo, y grupos 3-hidroxibutanoil (Robertson et al., 1981; McNeil et al., 1986; Philip- Hollingsworth et al., 1989; O’Neill et al., 1991; Breedveld et al., 1993).

Los EPS de S. fredii HH103 y NGR234 presentan la misma estructura (Rodriguez-Navarro

et al., 2014). Su unidad de repetición está compuesta de cinco residuos de D-glucosa,

dos residuos de D-galactosa y dos unidades de D-ácido glucurónico; además hay sustituciones de grupos piruvilo y acetilo (Figura 11).

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Figura 11. Estructura química de los EPS producidos por diferentes especies de Sinorhizobium y

Bradyrhizobium. a) EPS I y b) EPS II de S. meliloti 1021; c) EPS de S. fredii HH103 y NGR234; d) EPS de B. japonicum USDA110; e) EPS/NPS de B. elkanii USDA61. Figura adaptada de López-Baena et al. (2016).

El EPS lleva a cabo varias funciones importantes para la bacteria: captación de nutrientes del medio, protección frente a estreses ambientales como la desecación y frente a agentes antimicrobianos, y, además, interviene en la unión a superficies abióticas y a raíces de las plantas hospedadoras. El EPS también es el principal componente de la matriz de biopelículas (biofilms), por lo que resulta indispensable para su correcta formación (Fraysse et al., 2003; Downie, 2010; Rinaudi y Giordano, 2010; Janczarek, 2011). Asimismo, este polisacárido protege a la bacteria frente a ROS durante la infección de la planta (D’Haeze et al., 2004) y parece ser que es capaz de suprimir la respuesta defensiva de la planta (Jones et al., 2008).

La biosíntesis del EPS es un proceso complejo regulado tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional e influenciado por varios tipos de nutrientes, condiciones ambientales y flavonoides. Todos estos factores pueden afectar tanto al nivel de síntesis

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como a posibles modificaciones (Dunn et al., 1992; Cooper, 2007; Janczarek y Skorupska, 2011). El proceso de biosíntesis requiere la actividad coordinada de un complejo multiproteico localizado tanto en la membrana interna como en la externa (Janczarek, 2011), y consta de varias etapas (Becker, 2015):

i) Síntesis de los precursores nucleótido-azúcares.

ii) Síntesis de las unidades de repetición oligosacarídicas o síntesis directa del polisacárido por sucesiva o progresiva actividad de las glicosiltransferasas.

iii) Ensamblaje del polisacárido a partir de las unidades de repetición.

iv) Exportación del producto sintetizado.

La regulación de la producción de este polisacárido se ha estudiado principalmente en dos especies: S. meliloti y R. leguminosarum bv. trifolii (Becker et al., 1998; Janczarek, 2011). Normalmente, los genes involucrados en la síntesis del EPS se encuentran agrupados en grandes regiones génicas o clusters en el genoma bacteriano, ya sea en el cromosoma o en los megaplásmidos de los rizobios (Finan et al., 2001; Kaneko et al., 2000 y 2002; González et al., 2006; Young et al., 2006; Król et al., 2007; Reeve et al., 2010a, b).

En S. meliloti los genes que intervienen en la síntesis de EPS I forman un gran cluster

exo/exs (~35 Kb) localizado en el megaplásmido pSymB (Becker et al., 1993a, b;

Glucksmann et al., 1993a, b; Müller et al., 1993; Reuber y Walker, 1993; Finan et al., 2001). Esta región consta de 28 genes exo/exs organizados en varios operones entre los que se encuentran los genes que codifican enzimas para la síntesis de los precursores nucleotido-azúcares (exoB y exoN), enzimas involucradas en la unidad de ensamblaje (exoY, exoF, exoA, exoL, exoM, exoO, exoU, exoW), en las modificaciones o decoraciones (exoZ, exoH y exoV) y proteínas responsables de la polimerización de las unidades de repetición y transporte de las moléculas de EPS I (exoP, exoT, exoQ y exsA) (Becker et

al., 1993a, b; Glucksmann et al., 1993a, b; Müller et al., 1993; Reuber y Walker, 1993;

Becker et al., 1995a, b; Finan et al., 2001; Jofre y Becker, 2009). Además de los genes organizados en este cluster, existen otros genes involucrados en la síntesis de los precursores de los azúcares (exoC) y regulación del proceso de síntesis del mismo (exoD,

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et al., 1988; Reed et al., 1991; Uttaro et al., 1990; Reed y Walker, 1991; Keller et al.,

1995).

La fracción LMW del EPS I se genera por la escisión o fraccionamiento de la fracción HMW por acción de las glicanasas ExoK y ExsH, cuya función de escisión es susceptible de cambios producidos en las modificaciones de tipo acetilo y succinilo del EPS I de HMW (York y Walker, 1998).

Para la síntesis del EPS II se requiere la acción de otro cluster de aproximadamente 27 Kb compuesto por los genes exp, localizados en el plásmido pSymB a una distancia de 160 Kb del cluster exo/exs (Becker et al., 1997; Moreira et al., 2000).

En R. leguminosarum, sólo existe un tipo de EPS y su biosíntesis se lleva a cabo a través de un gran cluster denominado Pss-I (Król et al., 2007) de ~35 Kb y que comprende más de 20 genes conservados en casi todas las estirpes de R. leguminosarum (Sadykov et al., 1998; González et al., 2006; Young et al., 2006; Król et al., 2007; Reeve et al., 2010a y b).

S. fredii NGR234 y HH103 poseen una región de 28 Kb que contiene los genes exo

organizados en cuatro operones (Gray et al., 1990; Zhan y Leigh, 1990). Existen grandes regiones en este cluster que están muy relacionadas con zonas génicas de la región

exo/exs del EPS I de S. meliloti, lo que explica la similitud estructural entre sus EPS. Sin

embargo, existen algunas diferencias como la ausencia del gen exoH en S. fredii, lo que provoca que el EPS no posea decoraciones de tipo succinilo (Staehelin et al., 2006; Schmeisser et al., 2009; Rodríguez-Navarro et al., 2014).

En cuanto a la regulación del proceso de síntesis se han identificado varios genes reguladores, la mayoría de ellos represores, localizados tanto en el cromosoma (mucR,

exoR, exoS, exoD, expR, syrM y phoB) como en el megaplásmido pSymB de S. meliloti

(exsB, exoX y wggR). Entre estos reguladores se encuentra MucR, el cual parece ser un regulador global que juega un doble papel en S. meliloti: actúa en la regulación positiva de la síntesis del EPS I y negativa para la síntesis del EPS II (Bertram-Drogatz et al., 1997 y 1998; Rüberg et al., 1999; Bahlawane et al., 2008).

Durante el proceso simbiótico, en algunas interacciones el EPS parece ser indispensable para que la infección de las raíces de la planta hospedadora se lleve a cabo de forma correcta, sobre todo en las primeras etapas (Skorupska et al., 2006). El papel del EPS en

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la simbiosis con leguminosas de tipo indeterminado parece ser mucho más importante que con las de tipo determinado (Fraysse et al., 2003). Por ejemplo, mutantes de S.

meliloti o R. leguminosarum deficientes en la producción de EPS presentan un fenotipo

en los que no se desarrollan tubos de infección o dan lugar a tubos de infección aberrantes (mutantes en exoY o exoH), por lo que son incapaces de invadir las células del nódulo y, por lo tanto, no tiene lugar la fijación de nitrógeno (Rolfe et al., 1996; van Workum et al., 1997; Cheng y Walker et al., 1998). Sin embargo, la situación es diferente en estirpes de S. meliloti capaces de producir un KPS simbióticamente activo, como Rm41. Un mutante exoB de esta estirpe, carente de EPS, es capaz de inducir nódulos fijadores en alfalfa debido a que su KPS es capaz de sustituir funcionalmente al EPS (Williams et al., 1990; Reuhs et al., 1995). Se ha postulado que la fracción LMW del EPS I es la forma biológicamente activa en S. meliloti, de tal forma que actúa como señal simbiótica (Fraysse et al., 2003). Sin embargo, recientemente se ha descubierto que no es estrictamente necesaria para llevar a cabo la simbiosis y la subsiguiente fijación de nitrógeno, sino que con la fracción HMW del EPS I sería suficiente (Hajeewaka et al., 2016).

En el caso de HH103, un mutante deficiente en la producción de EPS (mutante exoA) es capaz de nodular en plantas tanto de tipo determinado como indeterminado, incluso un doble mutante en KPS y EPS sigue siendo efectivo en ambos tipos de plantas (Margaret- Oliver et al., 2012) Además, en HH103 la ausencia de EPS, no sólo no afecta a la nodulación en soja, sino que incrementa la capacidad competitiva de la bacteria para nodular en soja, aunque la disminuye en V. unguiculata (Rodríguez-Navarro et al., 2014). Por lo tanto, las alteraciones producidas en los diferentes polisacáridos y su efecto sobre la simbiosis, parece depender más de la pareja simbiótica en sí, que del tipo de nódulo que forme la planta hospedadora.

La ausencia del EPS puede dar lugar a una simbiosis efectiva como ocurre en S. fredii HH103 con soja o M. loti R7A con L. japonicus. Sin embargo, alteraciones estructurales en el EPS puede dar lugar a deficiencias severas en el proceso simbiótico en el caso de la interacción de M. loti R7A con L. japonicus (Kelly et al., 2013). Este fenómeno se produce debido a la presencia de un receptor de tipo quinasa (EPR3) que es capaz de reconocer y unir el EPS directamente, de forma que es capaz de discernir los EPS

33 compatibles e incompatibles con la planta y permitir así o no, el desarrollo de la simbiosis (Kawaharada et al., 2015 y 2017) (Figura 12).

Figura 12. Modelo de reconocimiento de rizobios compatibles mediante un proceso de dos pasos a través

del receptor EPR3. a) Paso 1: colonización e iniciación de la infección específica de hospedador iniciada por la unión de NF a los receptores NFR1 y NFR5, lo que permite la expresión del gen Epr3 en las células epidérmicas (círculos grises) y la curvatura del pelo radical encerrando al rizobio. Paso 2: La señalización por NFR1 y NFR5 continua y EPR3 percibe al EPS. b-e) resultado de la percepción de EPR3 del EPS compatible y truncado. b) el nivel básico de señalización de EPR3 promueve la infección. c) la percepción de EPS compatible incrementa la señalización y promueve una infección persistente. d) un EPS truncado activa la vía que bloquea la infección. e) alternativamente un mecanismo mediado por un correceptor puede bloquear la infección. Figura adaptada de Kawaharada et al. (2015).

7.4.1. El regulador transcripcional MucR

MucR es una proteína de unos 15,7 kDa perteneciente a la familia de reguladores transcripcionales Ros/MucR caracterizados por la presencia de un motivo de tipo “dedos de zinc” (de zinc-fingers) Cys2-His2 (Keller et al., 1995). Este regulador se encuentra

ampliamente distribuido en diversas proteobacterias como por ejemplo en A.

tumefaciens, en el cual fue descrito el primer regulador de tipo “dedos de zinc” en

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a secuencias palindrómicas, denominadas Ros/MucR boxes, que se localizan en regiones situadas aguas arriba de los genes diana (D´Souza-Ault et al., 1993; Bertram-Drogatz et

al., 1997; Janczarek y Skorupska, 2007).

En las bacterias en las que se encuentra, MucR/Ros regula diversos procesos y funciones como la biosíntesis del EPS en R. leguminosarum (Janczarek y Skorupska, 2007), S.

meliloti (Keller et al., 1995) y A. radiobacter (Tiburtius et al., 1996), la transición de la

fase S a G1 en el ciclo celular de Caulobacter (Fumeaux et al., 2014), la producción de alginato en Pseudomonas aeruginosa (Wang et al., 2015) o la expresión de los genes de virulencia, virC y virD, y un oncogen de plantas, ipt, localizados en el plásmido Ti en A.

tumefaciens (Close et al., 1985; Cooley et al., 1991; Chou et al., 1998). Además, MucR

está presente en bacterias patógenas de animales como en Brucella, donde este regulador es importante para la virulencia de la bacteria (Caswell et al., 2013) o para regular la expresión de los genes de quorum sensing y sistema de secreción de tipo IV (Dong et al., 2013). En R. leguminosarum bv. trifolii, RosR regula gran cantidad de procesos como la síntesis de componentes de la superficie celular (entre los que se encuentran los polisacáridos), movilidad y metabolismo bacteriano (Rachwal et al., 2015). En cuanto a su implicación en simbiosis, la inactivación de rosR da lugar a una simbiosis inefectiva con trébol (Janczarek et al., 2010), al igual que ocurre en la simbiosis de S. fredii CCBAU45436 con G. max JD17, donde MucR1 es esencial para el desarrollo de nódulos fijadores de nitrógeno (Jiao et al., 2016).

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37 El grupo de investigación en cuyo seno se han realizado los estudios contenidos en esta Tesis lleva más de 30 años trabajando en la simbiosis rizobio-leguminosa, más concretamente en la interacción de Sinorhizobium fredii HH103 con diversas leguminosas hospedadoras. En los últimos años las investigaciones de este grupo se han centrado en el estudio del papel simbiótico de diversos polisacáridos superficiales presentes en esta bacteria. En esta Tesis se ha pretendido profundizar en diversos aspectos relacionados con este objetivo general del grupo. Los objetivos concretos de esta Tesis son:

1. Caracterizar la región rkp-2 de S. fredii HH103 y estudiar su implicación en la producción de diferentes polisacáridos superficiales de esta bacteria.

2. Estudiar la importancia de los diferentes polisacáridos superficiales de S. fredii HH103 en la simbiosis con la leguminosa modelo Lotus.

3. Estudiar la regulación de la producción del EPS de S. fredii HH103 mediada por flavonoides.

4. Caracterizar los genes mucR1 y mucR2 de S. fredii HH103 y estudiar sus posibles efectos reguladores sobre genes involucrados en la producción de EPS.

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