En los rizobios, la expresión de los genes de nodulación y fijación de nitrógeno está sujeta a una doble regulación, positiva y negativa. De este modo se propicia una nodulación óptima y un eficiente metabolismo de la planta una vez fijado el nitrógeno atmósférico (Kondorosi et al., 1989; Loh y Stacey, 2003). La regulación positiva está mediada por los productos de los genes nodD y syrM (Long, 1996), mientras que la regulación negativa se lleva a cabo por una proteína represora codificada por el gen nolR (Sugawara y Sadowsky, 2013) (Figura 5).
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Figura 5. Esquema de regulación de la expresión de los genes nod mediada por los principales reguladores
en S. fredii HH103. NB: nod box, SB: syrM box. Las líneas acabadas en flechas significan activación, mientras que las acabadas en una línea transversal significan inhibición. Figura adaptada de Pérez-Montaño et al. (2016).
6.1. NodD
La proteína NodD pertenece a la familia de activadores transcripcionales de tipo LysR. Los miembros de esta familia tienen aproximadamente 35 kDa y poseen un dominio de unión a ADN de tipo hélice-vuelta-hélice en el extremo N-terminal. Frecuentemente muestran auto-represión y normalmente requieren de moléculas inductoras para llevar a cabo su actividad. De este modo, estos activadores son capaces de transducir las señales extracelulares directamente a transcripción génica (Schell, 1993). Estos inductores pueden afectar la interacción con el ADN por estimulación del cambio de afinidad en la unión con el ADN (Wang et al., 1992; Dangel et al., 2005) o alterar la arquitectura de la proteína (Hryniewicz y Kredich, 1994; Toledano et al., 1994; Parsek et
al., 1995; Rhee et al., 1998), por ejemplo cambiando la conformación de los activadores
para exponer dominios que interaccionan con la ARN polimerasa y facilitar así complejos de transcripción (Wek y Hatfield, 1988; Adhya et al., 1993; Kullik et al., 1995). Aunque existen evidencias que indican que NodD está directamente involucrado en la
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percepción de los flavonoides (Peck et al., 2006), no se ha demostrado que los flavonoides se unan directamente a esta proteína. Recientemente se ha propuesto que los flavonoides inducen aumentos transitorios en la concentración intracelular de Ca2+
de los rizobios, y que NodD actuaría posteriormente a dichos cambios (Moscatiello et
al., 2010). Asimismo, en Rhizobium tropici la proteína NodD2 es capaz de activar la
expresión de genes nod (y por tanto promover la producción de NF) en respuestas a altas concentraciones de sal en ausencia de flavonoides (del Cerro et al., 2017). En cualquier caso, durante la activación transcripcional, NodD se une a las secuencias denominadas nod box, compuestas por 55 pb altamente conservadas y localizadas en las regiones promotoras de los genes nod (Rostas et al., 1986; Fisher et al., 1988).
La proteína NodD se ha encontrado en todas las especies de rizobios (Spaink et al., 1987; Schlaman et al., 1998) y su número de copias varía entre 1 y 5 según la especie (Spaink, 2000). Las proteínas NodD de los diferentes rizobios tienen distinta sensibilidad a flavonoides, lo que provoca que cada rizobio pueda responder de modo diferente a los exudados de cada leguminosa (Horvath et al., 1987; Spaink et al., 1987; Bender et al., 1988).
Algunas especies de rizobios, por ejemplo R. leguminosarum bv. trifolii, tienen un solo gen nodD, mientras que B. japonicum, S. fredii, S. meliloti y R. tropici poseen de dos a cinco copias de este gen (van Rhijn et al., 1993). En concreto, las estirpes de S. fredii, como HH103, poseen dos copias del gen nodD, nodD1 y nodD2 (Vinardell et al., 2015). En S. fredii NGR234, nodD2 actúa como represor del operón nodABCIJnolOnoeI. A su vez, la transcripción de nodD2 en esta estirpe está mediada por SyrM2 debido a la presencia de una syrM box en su región promotora. Además, nodD2 está involucrado en la especificidad del hospedador, debido a que mutaciones en nodD2 en NGR234 siguen permitiendo la nodulación en plantas como Leucaena leucocephala pero da lugar a un fenotipo Fix- y a nódulos vacíos en Vigna unguiculata y Tephrosia vogelii
respectivamente (Kobayashi et al., 2004). Este tipo de estudios pone de manifiesto una interacción compleja entre los diversos reguladores de los genes nod.
6.2. NolR
El gen nolR se encuentra bastante conservado en el género Sinorhizobium (Sugawara et
15 (Kiss et al., 2001) e incluso en géneros relacionados como la alfaproteobacteria Brucella (Caswell et al., 2013). Este gen codifica una proteína perteneciente a la familia de los reguladores de tipo hélice-vuelta-hélice de modo que se une a secuencias conservadas no palindrómicas [(A/T) TTAG-N9-A(T/A)] regulando la expresión génica (Kondorosi et
al., 1991).
En S. meliloti, NolR modula la expresión del activador NodD y de los genes nod que codifican para el esqueleto de los NF (Kondorosi et al., 1991; Cren et al., 1994; Cren et
al., 1995), de modo que se ha propuesto que su efecto es el de asegurar la producción
de factores Nod plenamente decorados. Sin embargo, en S. fredii HH103 NolR reprime tanto los genes nod comunes como los específicos, además de la secreción de proteínas a través del T3SS, y potencia la producción de exopolisacáridos (Vinardell et al., 2004a; López-Baena et al., 2008). Más concretamente, se han encontrado regiones de unión de la proteína NolR en regiones de inicio de transcripción de los genes nodD1, nodD2, nodA,
ttsI-nodD2, nolR, hesB y nodZ (Kondorosi et al., 1991; Vinardell et al., 2004a),
demostrando que NolR es un regulador global que responde a factores ambientales para “afinar” la respuesta de las señales simbióticas.
Se han propuesto dos posibles modelos para explicar la interacción de NolR con las regiones del operador de los genes de nodulación (Lee et al., 2014) (Figura 6):
1.- NolR se une al operador dentro del inicio de transcripción del gen diana, de tal modo que podría competir directamente con la ARN polimerasa por el sitio de unión en la región promotora. Este modelo es lo que podría ocurrir en las zonas de unión de nodD1
nodZ y nolR, donde el operador se posiciona 15-60 pb aguas arriba de la región
codificante (Vinardell et al., 2004a).
2.- La unión de NolR al sitio del operador altera el reconocimiento de NodD sobre la caja
nod o la interaccion con la ARN polimerasa en el sitio de inicio de transcripción. De este
modo NolR puede que compita físicamente con NodD por el sitio de unión de la caja nod o que altere la región de unión al plegar el promotor impidiendo la unión de NodD, de modo que reprime la expresión de los genes de nodulación que se encuentran aguas abajo.
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Figura 6. Modelos de regulación de la expresión de los genes de nodulación por NolR. Figura adaptada de
Lee et al. (2014).
6.3. SyrM
SyrM tiene una secuencia aminoacídica similar a la de las proteínas NodD (Barnett y Long, 1990) y como tal, pertenece a la familia de activadores transcripcionales de tipo LysR (Henikoff et al., 1988). En S. meliloti, del cual se ha obtenido la mayoría de la información de este regulador, la transcripción de syrM se activa mediante la unión de NodD3 a una secuencia nod box situada aguas arriba de syrM y éste a su vez activa la transcripción de nodD3, formando así un circuito auto-amplificante (Swanson et al., 1993; Barnett et al., 1996; Barnett et al., 2004). Cabe destacar que NodD3 es uno de los reguladores transcripcionales de tipo LysR que no requiere compuestos específicos de la planta para activar la expresión de los genes nod, sino que es activado por SyrM (Maillet et al., 1990; Kondorosi et al., 1991; Swanson et al., 1993).
Además de nodD3, SyrM activa la transcripción del gen syrA, involucrado en la producción de exopolisacárido (EPS), ya que la sobre-expresión de este último gen provoca un incremento drástico de la producción de EPS I (Mulligan y Long, 1989; Barnett et al., 1998).
Para que se lleve a cabo la activación de la expresión tanto de nodD3 como de syrA, SyrM se une a unas secuencias específicas conservadas que se encuentran en regiones aguas arriba de ambos genes y a las que se les denomina SyrM box (Barnett et al., 1996).
17 De este modo, y al menos cuando se encuentra sobre-expresado, SyrM parece controlar de forma coordinada tanto la síntesis de los NF, vía nodD3, como la producción de EPS I, vía syrA. Este hecho no se lleva a cabo si la bacteria carece de alguno de los dos reguladores, nodD3 y/o syrA, ya que la sobre-expresión de syrM no tiene ningún efecto sobre los NF o la producción de EPS I en ausencia de alguno de los dos reguladores (Dusha y Kondorosi, 1993; Dusha et al., 1999). Aún en presencia de nodD3, la sobre- expresión de syrM sólo provoca una modesta activación de la expresión de los genes
nod (Barnett y Long, 2015).
En el caso de S. fredii HH103, el gen syrM se encuentra en el plásmido simbiótico y aguas arriba se localiza una secuencia nod box (NB19) (Vinardell et al., 2015), por lo que su transcripción se activa por la vía dependiente de flavonoides-NodD1. Se han identificado dos posibles SyrM box aguas arriba de dos operones que pueden estar regulados por SyrM, y entre los genes que los componen se localiza el regulador transcripcional nodD2 (Pérez-Montaño et al., 2016). Este sistema regulador ocurre de igual forma en la estirpe NGR234, donde syrM2 es activado por la vía flavonoides-NodD1, y, a su vez, activa la transcripción del regulador nodD2 (Kobayashi et al., 2004).