de l’atàxia de Friedreich. MCK = Model condicional cardíac, NSE i PRP models condicionals neuronals. N = test realitzat i no es varen detectar alteracions, S = test realitzat amb alteracions detectades (adaptat de Perdomini et al., 2013).
Test realitzat\Model de ratolí
KIKO/KIKI YG8R/YG22R MCK NSE PRP
Atàxia cerebel·losa i sensorial - Rotarod - Petjades N - S - - - - - S S Defectes sensorials - Electromiograma - - - S S Funció cardíaca - Ecocardiografia - - S S - Defectes motors - Activitat locomotora
- Test força “grip”
- - S S - - - - - N
25
2.
El metabolisme del Ferro en Saccharomyces cerevisiae
El ferro és el quart element més abundant a l’escorça terrestre, el que ha provocat que al llarg de l’evolució aquest metall de transició hagi estat utilitzat per un gran nombre d’organismes i avui en dia el ferro és un oligoelement essencial per pràcticament totes les formes de vida. En condicions fisiològiques, podem trobar el ferro en dos estats
d’oxidació o estats redox: una forma reduïda i soluble, Fe2+; o bé en forma oxidada i poc
soluble, Fe3+. Aquesta propietat permet que el ferro pugui ser utilitzat en un ampli
nombre de reaccions en diferents grups prostètics, com els centres Fe-S o els grups hemo,
ja que el potencial redox del parell Fe2+/Fe3+ va des de -300 fins a 700 mV, depenent del
lligant al que es trobi unit, un rang que coincideix amb el dels agents oxidants i reductors biològics (revisat a Crichton, 2001). Aquestes reaccions inclouen la cadena de transport d’electrons, el transport d’oxigen o bé la reducció de nucleòtids, pas clau en la síntesi del DNA. Aquestes mateixes característiques que fan del ferro un element molt útil per la cèl·lula també el converteixen en una arma de doble tall. El ferro lliure dins la cèl·lula pot reaccionar amb oxigen donant lloc a espècies reactives de l’oxigen que són altament perjudicials per la cèl·lula donat que poden reaccionar amb diferents macromolècules provocant la seva inactivació. Per aquest motiu, tant la captació, com l’emmagatzematge i la distribució del ferro dins la cèl·lula són processos que han de ser minuciosament controlats.
Un dels elements centrals en la regulació del metabolisme del ferro en un gran nombre d’organismes són els centres Fe-S. La utilització d’aquests centres com a sensors, permet relacionar els nivells de ferro extracel·lulars amb la seva utilització dins la cèl·lula el que permet donar una resposta transcripcional adequada en funció dels nivells de ferro presents al medi (revisat a Outten & Albetel, 2013).
26
2.1.Biosíntesi de centres Fe-S
Tant en llevats com en bacteris o eucariotes superiors la biosíntesi de centres Fe-S juga un paper central en la regulació del metabolisme del ferro. Aquest és un procés altament conservat al llarg de la evolució i els productes generats en aquesta reacció, els clústers Fe-S, són cofactors essencials per a moltes proteïnes i permeten que moltes reaccions cel·lulars puguin tenir lloc. La biosíntesi de centres Fe-S s’ha estudiat amb un alt nivell de detall utilitzant S. cerevisiae com a model el que ha permès entendre millor aquest procés i identificar-ne un gran nombre de proteïnes que en formen part.
La biosíntesi de centres Fe-S té lloc principalment al mitocondri i en podem diferenciar 3 processos principals: a) la biosíntesis dels clústers sobre la proteïna-bastida Isu1, b) la transferència dels clústers a les apo-proteïnes receptores, i c) l’exportació d’un component suposadament format de glutatió i sofre que servirà per generar els clústers per a les proteïnes citosòliques a través de la maquinària citosòlica CIA (de l’anglès, Cytosolic Iron-sulfur Assembly machinery) (Lill et al., 2012).
2.1.1.
Síntesis de novo de centres 2Fe-2S sobre Isu1
El primer pas de la biosíntesi dels centres Fe-S, és la generació d’un clúster 2Fe-2S sobre Isu1 que actua com a proteïna bastida, procés pel que es requereix sofre, ferro i electrons (Figura 6). En primer lloc, Isu1 forma un complex amb les proteïnes Nfs1 i Isd11 les quals s’encarreguen conjuntament de proporcionar el sofre necessari per a la biosíntesi del clúster. Nfs1 és un enzim amb activitat desulfurasa, mentre que Isd11 actua com a proteïna accessòria a la recció i és indispensable per a l’activitat de Nfs1. Juntes, catalitzen l’obtenció de sofre a partir de l’aminoàcid cisteïna generant com a subproducte alanina i per a la qual es requereix com a cofactor piridoxal fosfat (Mühlenhoff et al., 2004; Wiedemann et al., 2006). El sulfur obtingut forma un persulfit sobre la cisteïna activa de Nfs1 la qual està molt conservada. Acte seguit aquest persulfit es transfereix
27 sobre una cisteïna de Isu1 formant un nou persulfit. Per a la formació del clúster, el
persulfit format sobre les cisteïnes de Isu1 s’ha de reduir a S2- pel que es necessiten
electrons. Aquests electrons s’obtenen del NAD(P)H en una reacció catalitzada per un complex format per dues proteïnes: la ferredoxina Yah1 i la ferredoxina reductasa Arh1 (Webert et al., 2014). Finalment, s’incorpora el ferro sobre Isu1 per a la formació final del centre 2Fe-2S que posteriorment serà transferit a les proteïnes receptores. En aquest procés d’incorporació del ferro, s’han identificat els transportadors Mrs3 i Mrs4 com els responsables de l’import de ferro del citosol al mitocondri (Mühlenhoff et al. 2003; Froschauer et al. 2009) però no es sap exactament com aquest metall arriba fins a Isu1. Tot i que s’ha suggerit que frataxina podria ser el donador de ferro en aquest procés donada la seva habilitat d’interaccionar amb àtoms de ferro, aquest paper no està del tot clar. Recentment, s’ha suggerit que frataxina podria actuar com un regulador al·lostèric de la formació de clústers el que suposa que no tindria un paper essencial en aquest procés i per tant l’exclouria com a candidata a ser el donador de ferro (Adinolfi et al., 2009). D’acord amb aquesta hipòtesi, s’ha mostrat com un mutant puntual de Isu1 (M107I) reverteix els fenotips derivats de la manca de frataxina demostrant així que Yfh1 és dispensable per a la biosíntesi dels clústers (Yoon et al., 2012). El mecanisme proposat pel qual aquesta mutació permet prescindir de Yfh1 és precisament una regulació al·lostèrica sobre la desulfurasa Nfs1 produïda per aquesta mutació que seria similar a l’efecte que podria tenir Yfh1 (Pandey et al., 2013).
2.1.2.
Transferència dels clústers a les apo-proteïnes receptores
Un cop format el centre 2Fe-2S sobre Isu1, aquest s’ha de transferir sobre les proteïnes receptores. Per a dur a terme aquesta tasca existeixen una sèrie de proteïnes que en primer lloc alliberen el clúster de Isu1 en un procés que requereix ATP. Posteriorment existeixen diferents vies de maduració d’aquests clústers, les quals no es tractaran en aquest apartat, que serveixen tant per a la modificació dels clústers com per a la posterior transferència a proteïnes específiques (Figura 6).
28
El primer pas en la transferència dels clústers, és la unió de holo-Isu1 a la proteïna Jac1. Aquesta proteïna funciona conjuntament amb Ssq1 una xaperona de la família HSP70 la qual té un domini d’unió a ATP. Per tant, després de la unió de Jac1 amb Isu1, també s’uneix la proteïna Ssq1 unida a ATP. Seguidament, Ssq1 hidrolitza aquest ATP el que provoca una sèrie de canvis de conformació que afecten en primer lloc a la unió de Jac1 a aquest complex, i també a l’estructura de Isu1 (Andrew et al., 2006). Aquest canvi produït sobre Isu1 debilita la seva unió amb el centre 2Fe-2S fent que aquest sigui més accessible. Finalment, la glutarredoxina monotiòlica Grx5 pot accedir al clúster i transferir-lo directament a proteïnes receptores o bé a altres proteïnes que actuen en la transferència i maduració d’aquests centres (Rodríguez-Manzaneque et al., 2002; Uzarska et al., 2013). Per a que el cicle pugui tornar a començar, un cop s’ha hidrolitzat l’ATP i s’ha trencat la unió amb Jac1, s’uneix al complex format Ssq1-ADP i Isu1 la proteïna Mge1 que canvia l’ADP de Ssq1 per un ATP. Aquest canvi promou un nou canvi de conformació gràcies al qual es trenca el complex i Ssq1-ATP queda lliure per iniciar un nou cicle així com Isu1 queda de nou disponible per a la síntesi de nous clústers.
29 Figura 6. Biosíntesi de centres Fe-S al mitocondri. La biosíntesi de centres Fe-S té lloc al mitocondri i se’n diferencien 3 parts principals. 1) La biosíntesi de novo de centres 2Fe-2S sobre Isu1, en aquest procés participen la desulfurasa Nfs1 i la seva proteïna accessòria Isd11 que aporten el sulfur obtingut a partir de l’aminoàcid cisteïna; els transportadors Mrs3/4 i frataxina que aportarien el ferro; i finalment la ferredoxina i la ferredoxina reductasa (Arh1 i Yah1) aporten els electrons necessaris per al procés. 2) Per a la transferència dels centres des de Isu1 fins a les apo-proteïnes receptores participen les xaperones Jac1 i Ssq1, que catalitzen el pas del centre 2Fe-2S des de Isu1 fins a la proteïna Grx5 en un procés que depèn d’ATP. La proteïna Mge1 intercanvia el ADP resultant de la reacció per ATP podent així començar un nou cicle. 3) Des de Grx5 existeixen tota una sèrie de branques per a la maduració dels diferents clústers (extret de Lill et al., 2015)
2.1.3.
Maquinària de síntesi citosòlica (CIA)
La part central de biosíntesi de centres Fe-S i sobre la que giren tots els processos derivats es localitza al mitocondri i per això es requereix una segona maquinària, citosòlica, per a proporcionar els clústers als enzims tant citosòlics com nuclears que els requereixin que depèn de la fracció mitocondrial. Si bé aquest procés no està tant ben caracteritzat com el que té lloc al mitocondri, si que s’han identificat tota una sèrie de proteïnes que hi participen.
30
Aquesta maquinària citosòlica depèn del transportador Atm1 el qual es creu transporta un compost format per glutatió i algun element més derivat de la biosíntesi dels centres Fe-S al mitocondri. Aquest compost aporta sofre i és el que serveix com a precursor per la síntesi dels clústers al citosol. Aquest compost, denominat sovint X-S, s’uneix a la Grx3 un cop al citosol la qual s’uneix a les proteïnes Nbp35 i Cfd1 que serveixen com a proteïnes bastida. Acte seguit s’incorpora el ferro necessari tot i que se’n desconeixen les proteïnes que hi participen i, igual que passa al mitocondri, també es requereixen electrons que s’obtenen a traves de l’oxidació de NAD(P)H per part del complex format per les proteïnes Tah18 i Dre1. Per a la transferència final del clúster a les apo proteïnes receptores s’han identificat fins a 4 proteïnes que participen en aquest procés: Nar1, Cia1, Cia2 i Mms19 (revisat a Lill, Srinivasan, & Mühlenhoff, 2014). A banda de la dependència que mostra aquest procés de l’activitat del transportador Atm1, cal destacar que la majoria de les proteïnes implicades en la CIA són proteïnes que contenen centres Fe-S els quals són essencials per a les seves respectives activitats. Aquest fet reforça encara més la unió entre el procés que té lloc al mitocondri i la maquinària citosòlica.
31 Figura 7. Maquinària citosòlica de biosíntesi de clústers Fe-S (CIA). En un procés que depèn de la síntesi dels centres al mitocondri, tot comença amb l’exportació d’un compost X-S que conté glutatió i sofre per part del transportador Atm1. 1) Un cop al citosol aquest compost serveix a les proteïnes Cfd1 i Nbp35 per a començar la síntesi dels centres. En aquest procés el complex format per les proteïnes Dre2 i Tah18 aporta el poder reductor. Es desconeix d’on surt el ferro necessari tot i que es creu que la proteïna Grx3 participa en aquest procés. 2) Finalment, el centre sintetitzat sobre les proteïnes-bastida Cfd1 i Nbp35 es transfereix a les proteïnes receptores a través d’una sèrie de proteïnes que participen en la transferència d’aquests clústers (Nar1, Cia1, Cia2 i Mms19) (extret de Lill, Srinivasan, & Mühlenhoff, 2014)
2.2.Regulació transcripcional del metabolisme del ferro: els regulons YAP5 i
AFT1
A fi de controlar al màxim la circulació de ferro dins la cèl·lula, les proteïnes implicades en aquests processos estan controlades principalment a nivell transcripcional. Depenent de si els gens participen en la resposta a alts nivells de ferro o a baixos nivells de ferro podem classificar-los en dos grups. El primer, la resposta a alts nivells de ferro, és el que es denomina reguló YAP5 i tot i que no és molt conegut i se’n coneixen pocs gens que en formin part regula l’emmagatzematge de ferro i està regulat pel factor transcripcional Yap5 del qual en pren el nom. Per altra banda, la resposta a baixos nivells de ferro està regulada pel factor transcripcional Aft1, i en menor mesura el seu paràleg Aft2, i el grup
32
de gens el qual regula se’l denomina reguló del ferro o reguló AFT1 (Yamaguchi-Iwai et al., 1996).
Figura 8. Regulació transcripcional del metabolisme del ferro en S. cerevisiae. En condicions de suficiència de ferro, es produeixen centres Fe-S al mitocondri que serveixen com a senyalitzadors de la regulació transcripcional del metabolisme del ferro. En aquesta situació, per una banda s’activa el reguló Yap5 que promou l’emmagatzematge de ferro a través de l’expressió del gen CCC1. Per altra banda, s’inhibeix l’activitat del reguló Aft1 que es manté al citosol fent impossible l’expressió dels gens que formen el reguló del ferro. Els detalls de cada regulació es troben al text.
2.2.1.
El reguló YAP5
Donat que el ferro és un element tòxic a altes concentracions és essencial regular-ne la seva distribució a la cèl·lula. El llevat Saccharomyces cerevisiae pot emmagatzemar ferro dins la vacuola com a reserva en una forma innòcua. S’ha identificat un únic transportador de ferro citosol – vacuola, denominat CCC1 (Li et al., 2001). Aquest transportador, es regula a la baixa en condicions de deficiència de ferro però quan les concentracions d’aquest metall al medi són elevades, la seva expressió augmenta. El factor transcripcional que en regula l’expressió és Yap5, un factor transcripcional de la
33 família Yap els quals modulen l’expressió de diferents gens en diferents situacions d’estrès (Li et al., 2008). Posteriorment a la identificació d’aquest factor transcripcional, es van dur a terme estudis transcriptòmics per a identificar més gens regulats per Yap5 i que formessin part de la resposta a alts nivells de ferro. Tot i que no s’han identificat un gran nombre de gens regulats directament per Yap5, a banda de CCC1 es va identificar els gens de la glutarredoxina 4 (GRX4) i el gen TYW1 relacionat amb la síntesi de tRNAs (Li et al., 2011; Pimentel et al., 2012). La troballa de que l’expressió de GRX4 està regulada per Yap5 és altament interessant ja que permet establir una relació directe entre la resposta a alts nivells de ferro, regulada per Yap5, i la resposta a baixos nivells de ferro, regulada per Aft1; ja que la localització de Aft1, i per tant la seva activitat, està regulada entre altres proteïnes per Grx4 (Pujol-Carrion et al., 2006). Per tant, en condicions on els nivells de ferro són elevats, s’indueix Grx4 i aquesta inhibiria l’activitat de Aft1 promovent d’aquesta manera que no s’indueixin els gens regulats per aquest factor de transcripció.
L’activació de Yap5 està regulada pel contingut de ferro, però, quins són els mecanismes pels quals es regula aquest factor de transcripció? La comparació amb proteïnes de la seva mateixa família com el factor de resposta a estrès Yap1, va permetre la observació que al contrari que Yap1, Yap5 no conté cap seqüencia d’exportació nuclear (NES) el que fa que sempre es localitzi al nucli, però té conservats dos dominis rics en cisteïnes que són importants per la seva regulació donat que la mutació d’aquestes cisteïnes a alanines bloquejava l’activitat de Yap5 (Li et al., 2008). Tot i que en un principi es creia que el ferro podria actuar directament sobre aquests dominis rics en cisteïnes induint la formació de ponts disulfur, un estudi més recent ha demostrat que la regulació de Yap5 depèn directament dels centres Fe-S (Rietzschel et al., 2015). Concretament, s’ha descrit que Yap5 funciona com un homodímer, i que quan aquest homodímer uneix dos centres Fe-S es produiria un canvi de conformació que dóna lloc a la forma activa de Yap5. Aquest mecanisme de regulació permetria unir la utilització del ferro, en forma de biosíntesi de clústers Fe-S, amb la regulació dels seus nivells al citosol i com a conseqüència a altres compartiments a través tant de la regulació de CCC1 com de GRX4 que inhibiria l’activitat de Aft1 i per tant evitaria una sobrecàrrega de ferro.
34
2.2.2.
El reguló del ferro o reguló AFT1
A banda del reguló Yap5, la resposta més estudiada en llevat és la que es dóna en condicions de baixa biodisponibilitat de ferro. En aquestes condicions, S. cerevisiae activa una sèrie de gens denominats en conjunt com el reguló del ferro activats pel factor transcripcional Aft1 i en menor mesura Aft2 (Yamaguchi-Iwai et al., 1996). Aquesta resposta té com objectiu incrementar la biodisponibilitat de ferro a la cèl·lula a través d’induir la captació de ferro amb transportadors d’alta afinitat, la mobilització de reserves de la vacuola i una remodelació metabòlica que té com a objectiu optimitzar l’ús del ferro a la cèl·lula. Aquests objectius es descriuen a continuació.
Taula 2. Gens regulats pels factors transcripcionals Aft1 i Aft2. Resum dels gens regulats per Aft1