dèficit de frataxina en Saccharomyces cerevisiae
David Alsina Obiols
http://hdl.handle.net/10803/390945
ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.
ADVERTENCIA. El acceso a los contenidos de esta tesis doctoral y su utilización debe respetar los derechos de la persona autora. Puede ser utilizada para consulta o estudio personal, así como en actividades o materiales de investigación y docencia en los términos establecidos en el art. 32 del Texto Refundido de la Ley de Propiedad Intelectual (RDL 1/1996). Para otros usos se requiere la autorización previa y expresa de la persona autora. En cualquier caso, en la utilización de sus contenidos se deberá indicar de forma clara el nombre y apellidos de la persona autora y el título de la tesis doctoral. No se autoriza su reproducción u otras formas de explotación efectuadas con fines lucrativos ni su comunicación pública desde un sitio ajeno al servicio TDR. Tampoco se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al contenido de la tesis como a sus resúmenes e índices.
derivades del dèficit de frataxina en
Saccharomyces cerevisiae
David Alsina Obiols
Estudi de les adaptacions metabòliques
derivades del dèficit de frataxina en
Saccharomyces cerevisiae
David Alsina Obiols
2016
Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques
Memòria per optar al grau de Doctor per la Universitat de
Lleida
Programa de Doctorat en Salut (0906)
Directors de la tesi
Resum
en la producció de ROS juntament amb l’acumulació de ferro provocada per l’activitat d’Aft1 i les seves dianes.
Per altra banda, es va analitzar l’implicació de la proteïna Yhb1 (Yeast flavoHemoglobin 1), en els fenotips observats, i es va observar que la seva deleció impedeix l’activació del reguló del ferro en absència de Yfh1. Aquest fenotip és conseqüència de l’augment en els
nivells intracel·lulars d’òxid nítric que fan que les soques deficients en YHB1 siguin més
resistents a l’estrès oxidatiu, que es creu que és el responsable de l’activació d’Aft1.
Resumen
La Ataxia de Friedreich es una enfermedad neurodegenerativa que sigue un patrón de herencia autosómico recesivo. La causa de la enfermedad es una mutación en el gen denominado FRDA que provoca una baja expresión de este gen y como consecuencia, los niveles de su producto, la proteína frataxina, se encuentran alrededor de un 10-30% en comparación con individuos sanos no portadores. Frataxina es una proteína mitocondrial altamente conservada a lo largo de la evolución, de la cual no se conoce su función con precisión aunque se ha sugerido que guarda relación con el metabolismo del hierro. La hipótesis más aceptada es que frataxina participa en la biosíntesis de unos cofactores denominados centros Fe-S. Ya que esta es una proteína muy conservada, se han utilizado un gran número de organismos como modelos de estudio entre los cuales se encuentra la
levadura Saccharomyces cerevisiae donde el déficit de Yfh1, la proteína homóloga de
crecimiento observada anteriormente. Otros efectos que pueden llevar a esta parada son el daño oxidativo producido por el incremento en la producción de ROS junto con la acumulación de hierro provocada por la actividad de la proteína Aft1 y de sus dianas.
Por otro lado, se analizó la implicación de la proteína Yhb1 (Yeast flavoHemoglobin 1) en los fenotipos observados, y se observó que la mutación de esta proteína impide la activación del regulón del hierro en ausencia de Yfh1. Este fenotipo es consecuencia del aumento en los niveles intracelulares de óxido nítrico que hacen que las cepas deficientes en YHB1 sean más resistentes al estrés oxidativo, que se cree que es el responsable de la activación de Aft1.
Abstract
Friedreich ataxia is a neurodegenerative disease with an autosomal recessive inheritance. The cause of the disease is a mutation in the FRDA gene that leads to a decreased expression and consequently the levels of its product, the protein frataxin, are around 10-30% compared to non-affected individuals. Frataxin is a mitochondrial protein that is highly conserved among evolution and its function is not precisely known although it was suggested that is related to iron metabolism. The most accepted hypothesis is that frataxin is involved in the biosynthesis of the cofactors known as iron-sulfur clusters. As it is a highly conserved protein, many organisms have been used as models like the yeast Saccharomyces cerevisiae where the lack of Yfh1, the Yeast Frataxin Homolog, induce the
On the other hand, we analyzed the role that plays Yhb1 (Yeast flavoHemoglobin 1) in the observed phenotypes, and we observed that the deletion of this gene impairs the activation of the iron regulon in the absence of frataxin. This phenotype is due to the increase in nitric oxide levels that promote a higher resistance of YHB1 deficient strains to oxidative stress. Thus, is believed that Aft1 activation may be dependent on the increase of ROS.
I finalment… això ja està aquí!! Tenia moltes ganes de començar aquest apartadet perquè és molta gent la que m’ha ajudat durant aquests 4-5 anys des que vaig aterrar al laboratori de bioquímica per fer el màster i posteriorment el doctorat, així que espero no deixar-me a ningú.
En primer lloc, als meus directors, el Jordi i el Kim. Al Kim per oferir-nos la possibilitat de quedar-nos als que estudiàvem aquí, a la Universitat de Lleida, de formar part del seu grup. Per la confiança, per totes les tardes de “brain-storming” de les quals encara conservo aquells complicats esquemes (hem sembla que els emmarcaré i tot!), per tots els consells i frases lapidàries que et feien rumiar una mica més i trobar nous camins amb els que no havies pensat. Al Jordi, perquè si a dia d’avui sóc aquí en gran part és gràcies a ell. Per tots els consells, per aguantar totes les meves visites al despatx i sempre tenir temps per atendre els meus dubtes. Per tot el que m’ha ensenyat aquests anys a nivells científic, pels debats interessantíssims a l’hora del cafè, i un llarg etc. mil gràcies.
nice words every day. A la resta del laboratori de BQ, Ana, Rosa, Elena, Fabien, Sandra i a tots els estudiants que han anat passant aquests anys dels que sempre n’aprens alguna coseta.
A les noies de proteòmica; a la Isu, per tota la ajuda tècnica quan l’he necessitat; i la Maria Alba per aquest riure i aquesta alegria que contagia per allà on passa. Al grup de BML, a l’Enric Herrero per tots els seus consells, preguntes als seminaris, per estar sempre disponible a donar un cop de mà i a resoldre dubtes; a la resta del grup per tota la seva ajuda a nivell tècnic durant aquests anys com les classes de micromanipulador (perdoneu per les agulles trencades!). A la resta de gent del IRB que sempre han estat disponibles per a qualsevol cosa en especial als de la tercera planta, CYCs i FPMs. Menció especial als futboleros Dani, Javi, Jose, Omar, Paolo, etc. Als amics d’aquí, amb els que tantes estones hem compartit, Nati, Isidre, Tania, Pau i Maria. Gràcies per totes les partides a la bolera, sopars, excursions per Aigües Tortes, per la visita a Siurana, per moltes altres coses però en especial pel vostre suport d’aquests últims mesos, per interessar-vos per mi i animar-me en moanimar-ments de dificultat.
A la Marta, no se el que faria sense tu. Perquè ja són molts anys junts, passant per moments bons i altres que no tant, però tu sempre m’has animat a tirar endavant i m’has donat suport, inclòs estant lluny d’aquí. Per tots els detalls que tens dia rere dia, perquè només tu pots convertir un dia horrorós en un bon dia. Per això tinc molt clar que si avui sóc aquí és també gràcies a tu.
superQuini i al David, per totes les xerrades que hem tingut aquest any anant cap al camp i pels sopars de futbol3.
Al consell de savis, Noel, Adrià, Javi, Nekane, Raul, Albert, Lucia per seguir units després de la carrera tot i que cadascú estigui a llocs diferents.
Finalment vull agrair a la meva família tot el suport d’aquests anys, no només aquests últims de tesi sinó des que vaig marxar de casa per començar a estudiar aquí a Lleida. En especial a les persones més lluitadores i treballadores que conec, els meus pares. Gràcies per tot, per confiar en mi i per ajudar-me sempre que ho he necessitat al llarg d’aquesta pila d’anys. Gràcies a la resta de la família Eva, Sandra, Dani, Miquel, Iaia, a la tia Esther (la tia preferida), Cristina, Mireia, Montserrat. No hem vull deixar als peques, Ariadna, Laia, Marc i Xavi que sempre hem treuen un somriure amb les seves ocurrències.
Abreviatures ____________________________________________________________ 1
Introducció _____________________________________________________________ 5
1. L’Atàxia de Friedreich _____________________________________________________ 7
1.1. Frataxina, una proteïna ancestral _______________________________________________ 10
1.2. Funció de Frataxina __________________________________________________________ 12
1.2.1. Emmagatzematge de Ferro _________________________________________________ 12
1.2.2. Control de l’estrès oxidatiu i la generació de ROS _______________________________ 14
1.2.3. Frataxina a la cadena de transport electrònic ___________________________________ 15
1.2.4. Frataxina en la biosíntesi de grups hemo i centres Fe-S ___________________________ 15
1.3. Models per a l’estudi de frataxina i l’Atàxia de Friedreich ___________________________ 18
1.3.1. Models cel·lulars __________________________________________________________ 19
1.3.2. Models pluricel·lulars ______________________________________________________ 22
2. El metabolisme del Ferro en Saccharomyces cerevisiae _________________________ 25 2.1. Biosíntesi de centres Fe-S _____________________________________________________ 26
2.1.1. Síntesis de novo de centres 2Fe-2S sobre Isu1 __________________________________ 26 2.1.2. Transferència dels clústers a les apo-proteïnes receptores ________________________ 27
2.1.3. Maquinària de síntesi citosòlica (CIA) _________________________________________ 29
2.2. Regulació transcripcional del metabolisme del ferro: els regulons YAP5 i AFT1 __________ 31
2.2.1. El reguló YAP5 ____________________________________________________________ 32
2.2.2. El reguló del ferro o reguló AFT1 _____________________________________________ 34
2.2.2.1. Sistemes de captació de ferro _____________________________________________ 35
2.2.2.2. Remodelació metabòlica en situacions de dèficit de ferro ______________________ 36
2.2.2.3. Regulació de Aft1 _______________________________________________________ 38
2.1. Paral·lelismes amb el metabolisme del ferro d’eucariotes superiors ___________________ 40
3. El metabolisme energètic de Saccharomyces cerevisiae _________________________ 41 3.1. Metabolisme respiratori ______________________________________________________ 42
3.1.1. L’AMPK en llevat: Snf1 _____________________________________________________ 43
3.1.2. El factor transcripcional Adr1 _______________________________________________ 45
3.1.3. El factor transcripcional Cat8 ________________________________________________ 47
4. L’estrès oxidatiu _________________________________________________________ 47
4.1. Generació de les espècies reactives de l’oxigen (ROS) ______________________________ 48
4.1. Propietats de les diferents ROS ________________________________________________ 49
4.2. Defenses antioxidants ________________________________________________________ 51
4.2.1. Superòxid dismutases (SODs) _______________________________________________ 54
4.2.3. Peroxidases ______________________________________________________________ 55
4.2.4. Sistema glutaredoxina _____________________________________________________ 56
4.2.4.1. Les GRX diotiòliques ____________________________________________________ 57
4.2.4.2. Les GRX monotiòliques __________________________________________________ 58
4.2.5. Altres sistemes enzimàtics de reparació del dany oxidatiu ________________________ 60
4.3. Redox signaling, les espècies reactives de l’oxigen com a senyalitzadors _______________ 61
Objectius _______________________________________________________________ 65
Materials i Mètodes ______________________________________________________ 69
1. Microorganismes i condicions de cultiu _____________________________________ 71
1.1. Soques de Saccharomyces cerevisiae utilitzades i condicions de creixement ____________ 71 1.2. Mesura del temps de generació ________________________________________________ 73
1.3. Assajos de viabilitat __________________________________________________________ 74
1.4. Creixement de bacteris (Escherichia coli) _________________________________________ 74 2. Mètodes d’anàlisi de proteïnes ____________________________________________ 75
2.1. Obtenció d’extractes proteics __________________________________________________ 75
2.2. Quantificació d’extractes proteics ______________________________________________ 75
2.3. Mètodes electroforètics ______________________________________________________ 75
2.3.1. SDS-PAGE _______________________________________________________________ 75
2.3.2. Electroforesi Bidimensional _________________________________________________ 78
2.3.2.1. Primera Dimensió: Isoelectroenfoc _________________________________________ 80
2.3.2.2. Segona Dimensió: SDS-PAGE ______________________________________________ 81
2.4. Immunodetecció de Proteïnes, Western Blot _____________________________________ 82 2.5. Mètodes de Tinció de Proteïnes ________________________________________________ 84
2.6. Proteòmica Dirigida mitjançant MRM (Multiple Reaction Monitoring) _________________ 86 2.6.1. Obtenció d’extractes ______________________________________________________ 86
2.6.2. Digestió en solució ________________________________________________________ 86
2.6.3. Purificació en columna C18 _________________________________________________ 87
2.6.4. Anàlisi per espectrometria de masses _________________________________________ 88
3. Mètodes de Biologia Molecular ____________________________________________ 90
3.1. Electroforesi d’àcids nucleics __________________________________________________ 90
3.2. Transformació de bacteris _____________________________________________________ 91
3.3. Purificació de DNA plasmídic __________________________________________________ 91
3.4. Amplificació de DNA plasmídic _________________________________________________ 91
3.5. Transformació de Llevats _____________________________________________________ 92
3.7. Colony PCR_________________________________________________________________ 95
3.8. Anàlisi de l’expressió gènica ___________________________________________________ 97
3.8.1. Extracció de RNA total _____________________________________________________ 97
3.8.2. Transcripció reversa i producció de DNA codificant (cDNA) ________________________ 97
3.8.3. PCR quantitativa o a temps real (RT-PCR) ______________________________________ 99
4. Mesura de Ferro intracel·lular _____________________________________________ 99
5. Activitats enzimàtiques __________________________________________________ 100
5.1. Aconitasa _________________________________________________________________ 100
5.2. Activitat peroxidasa lligada a grups Hemo _______________________________________ 101
5.2.1. Citocrom C _____________________________________________________________ 101
5.2.2. Yhb1 __________________________________________________________________ 102
6. Microscòpia de fluorescència _____________________________________________ 102
6.1. Anàlisi de proteïnes marcades amb GFP ________________________________________ 103
6.2. Tinció nuclear amb DAPI _____________________________________________________ 103
7. Mètodes fluorimètrics ___________________________________________________ 104
7.1. Mesura de la producció de Superòxid (DHE) _____________________________________ 104
7.2. Mesura de la producció d’Òxid Nítric (DAF-FM DA) _______________________________ 105
8. Mètodes estadístics _____________________________________________________ 105
Resultats _____________________________________________________________ 107
CAPÍTOL 1: Estudi de la remodelació metabòlica en cèl·lules deficients en YFH1 i de la
implicació de Adr1 i Cth2 ________________________________________________ 109
1. Anàlisi proteòmica de la deficiència de Yfh1 _________________________________ 111
1.1. Validació de dianes _________________________________________________________ 118
2. Estudi del factor transcripcional Adr1 ______________________________________ 120
2.1. Canvis en els nivells de proteïna i la localització d’Adr1 després de la repressió de frataxina _
_________________________________________________________________________ 120
2.2. Estudi de Adr1 en mutants GRX5 ______________________________________________ 125 2.3. Anàlisi de l’efecte de diferents estressos sobre Adr1 ______________________________ 126
CAPÍTOL 2: Estudi de la Flavohemoglobina de llevat YHB1 en deficiència de Frataxina i la
seva relació amb el Metabolisme del Ferro __________________________________ 139
1. Inducció de YHB1 en absència de Frataxina _________________________________ 141
2. Relació entre Yhb1 i l’activació del reguló del ferro ___________________________ 144
2.1. Mesura de la producció de espècies reactives de l’oxigen i d’òxid nítric _______________ 147
2.2. Regulació de la localització d’Aft1 en condicions d’estrès oxidatiu ___________________ 151
CAPÍTOL 3: Anàlisi per proteòmica dirigida (MRM) de diferents dianes afectades en els
mutants de frataxina ____________________________________________________ 155
1. Selecció de dianes, rang dinàmic __________________________________________ 157
2. Estudi de proteòmica dirigida en les soques BQS201 i BQS255 __________________ 161
Discussió ______________________________________________________________ 169
1. Adaptació metabòlica en absència de Yfh1: el paper d’Adr1 i Cth2 _______________ 171
1.1. La inactivació d’Adr1: un mecanisme de resposta front l’estrès oxidatiu? ______________ 172
1.2. Cth2, la baula perduda: Frataxina no és essencial en la biosíntesi de centres Fe-S _______ 174
2. L’activació d’Aft1 en absència de frataxina, una via depenent de redox signaling? __ 176 2.1. L’estrès oxidatiu en la fisiopatologia de l’Atàxia de Friedreich _______________________ 179
3. Sobre la funció de Frataxina, podem parlar d’una proteïna moon-lightning? ______ 180
Conclusions ____________________________________________________________ 185
Bibliografia ____________________________________________________________ 191
2-DE Electroforesi Bidimensional
3-NT 3- Nitrotirosina
3'-UTR 3'- Untranslated Region
5'-UTR 5'- Untranslated Region
ACN Acetonitril
ADP Adenosina 5'-difosfat
ARE AU Rich Elements
ATP Adenosina 5'-trifosfat
BPS Bathophenanthroline
disulfonic acid
CBB Comassie Brilliant Blue
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate CIA Cytosolic Iron-Sulfur cluster
Assembly machinery
DAF-FM DA 4-Amino-5-methylamino- 2′,7′-difluorofluorescein diacetate
DAPI
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, DHE Dihydroethidium
DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Àcid desoxiribonucleic
DRG Dorsal Root Ganglion
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylenediaminetetraacetic
acid,
FAD Flavina
adenina-dinucleòtid
FRDA Atàxia de Friedreich
Fxn Frataxina
GFP Green Fluorescent Protein
GSH Glutatió reduït
GSSG Glutatió oxidat
HPLC High Performance Liquid
Chromatography
IAM Iodoacetamida
IEF Isoelectroenfoc
iHDAC Inhibidors de Histones
Desacetilases
IPG Immobylized pH Gradient
iPSC Induced Pluripotent Stem
Cells
IRE Iron Responsive Elements IRP Iron Response Protein
LB Medi Luria-Bertani
MD Menadiona
MRM Multiple Reaction Monitoring
mRNA RNA missatger
NADH Nicotina Adenina
dinucleòtid
NADPH Nicotina Adenina
dinucleòtid Fosfat
NO Òxid nítric
OD600 Densitat òptica a 600nm
ONOO- Peroxinitrit
pb Parells de bases
PBS Tampó fosfat salí
PEG Polietilenglicol
PVDF Polyvinylidene fluoride
RET Reverse Electron Transfer
RHB Tampó de rehidratació
RNA Àcid ribonucleic
RNS Espècies Reactives del
Nitrogen
ROS Espècies Reactives del
Oxigen
SC Medi Sintètic Complert
TAE Tampó Tris-Acetat-EDTA
TBST Tampó Tris Salí - Tween 20
TCA Àcid Tricloroacètic
TE Tris-EDTA
TFA Àcid Trifluoroacètic
tRNA RNA de transferència
YAC Yeast Artificial Chromosome
YPD Medi Ric (Yeast
extract-Peptone-Dextrose)
YPG Medi Ric (Yeast
7
1.
L’Atàxia de Friedreich
L’Atàxia de Friedreich és una malaltia neurodegenerativa descrita a finals del segle XIX pel metge alemany Nikolaus Friedreich de qui va adquirir-ne el nom. Friedreich va observar en un grup de pacients que durant la pubertat es començaven a manifestar una sèrie símptomes característics, concretament: atàxia, disàrtria, pèrdues de sensibilitat, debilitat muscular, escoliosis, peu buit (pes cavus) i símptomes cardíacs. Posteriorment també s’ha descrit una major incidència en diabetis que en la resta de població. Es considera una malaltia rara que segueix un patró d’herència autosòmic recessiu. La freqüència de portadors oscil·la, depenent de la zona, entre 1:50 i 1:100, mentre que els afectats per la malaltia són aproximadament 1:50.000, el que converteix aquesta malaltia en la forma d’atàxia hereditària més comú.
La mutació responsable de la malaltia és una expansió de triplets GAA en el primer intró
del gen FRDA o X25, al cromosoma 9, que codifica per la proteïna mitocondrial frataxina
(Campuzano et al., 1996). Aquesta expansió de triplets, que en pacients pot arribar a tenir fins a més de 1000 còpies, produeix una davallada en els nivells de proteïna frataxina fins un 5-30% dels nivells normals (Campuzano et al., 1997). El nombre d’expansions GAA té una relació inversament proporcional amb l’edat on es comencen a manifestar els primers símptomes de la malaltia i també en determina la severitat dels mateixos (Filla et al., 1996; Isnard et al., 1997; McDaniel et al. 2001).
8
temps es formaria aquesta triple hèlix de DNA. El pre-mRNA transcrit fins al moment estabilitzaria la cadena de DNA restant (Grabczyk & Usdin, 2000) (Figura 1B).
Finalment, també s’ha suggerit que l’expansió de triplets, juntament amb els mecanismes suggerits anteriorment, provoca una compactació de la cromatina el que fa impossible la transcripció de frataxina. En aquest sentit, s’ha observat que amb tractaments amb inhibidors de les Histones Deacetilases (iHDAC) és possible incrementar els nivells de transcrit de frataxina, resultats que donen suport a aquesta hipòtesi i que més a més tenen un ampli potencial terapèutic (Herman et al., 2006).
10
1.1.
Frataxina, una proteïna ancestral
[image:36.595.160.415.368.654.2]Frataxina és una proteïna molt conservada al llarg de l’evolució i se’n poden trobar homòlegs en pràcticament tots els regnes. La seva estructura formada per dos hèlix alfa unides per una sèrie de fulles beta antiparal·leles està altament conservada i es considera única (Figura 2). Tot i l’alt grau de conservació en l’estructura tridimensional, l’estabilitat d’aquesta proteïna varia sensiblement entre espècies. Un dels factors responsables de les diferències en l’estabilitat de la proteïna és l’extrem C-terminal. Mentre que en Yfh1 (l’homòleg de llevat) aquest extrem és pràcticament inexistent, en la forma humana aquest fragment s’insereix entre les dues hèlix alfa protegint així el nucli hidrofòbic de la proteïna incrementant així l’estabilitat de la proteïna (Adinolfi et al., 2004).
11 Frataxina és una proteïna mitocondrial i com a tal té un pèptid senyal en el seu extrem N-terminal. Ben aviat es va identificar, tant per Yfh1 com per la frataxina de ratolí, que la
peptidasa MPP-β (de l’anglès, Mitocondrial Processing Peptidase) interaccionava amb
frataxina i era la responsable del seu processament (Koutnikova et al., 1998; Branda et al., 1999). Aquest processament comporta dos talls seqüencials en l’estructura de frataxina per la mateixa peptidasa, el que genera en primer lloc una forma intermediària de frataxina i posteriorment la forma madura. Els llocs de tall canònics descrits són entre els aminoàcids 41-42 i entre els aminoàcids 80-81 per a la frataxina humana, tot i que s’han identificat altres formes menys abundants que correspondrien a llocs de tall alternatius (Figura 3). En aquests mateixos treballs, es va demostrar que la forma madura de frataxina (aa 81-210) és totalment activa i capaç de millorar la supervivència i els fenotips de cèl·lules deficients en frataxina (Condò et al., 2007; Schmucker et al., 2008).
Tot i la demostració que la forma m81-210 és la forma activa i actua al mitocondri, existeix cert debat sobre el paper que podria desenvolupar la forma intermediària. En primer lloc es va demostrar que el processament de la forma intermediària és més lent que el de la forma precursora, el que suggeria que aquest podria ser un mecanisme de control dels nivells de frataxina madura (Cavadini et al., 2000). Més recentment, s’ha suggerit que les diferents formes de frataxina juguen diferents papers en la funció de frataxina com podria ser en la biosíntesi de centres Fe-S (Gakh et al., 2010).
12
Figura 3. Isoformes de frataxina. A) Frataxina es processa en l’import al mitocondri en dos talls successius donant lloc a una forma intermediària (42-210) i posteriorment a la forma madura (81-210) tot i que s’han detectat formes madures alternatives (m56 i m72) (Schmucker et al., 2008). B) Isoformes de frataxina generades per splicing alternatiu (Xia et al., 2012). Algunes d’aquestes isoformes no presentarien l’exò 3 i/o modificacions en l’exò 1.
1.2.
Funció de Frataxina
Vint anys d’estudi després del seu descobriment com la responsable de l’Atàxia de Friedreich (Campuzano et al., 1996), la funció concreta de frataxina a la cèl·lula segueix essent una incògnita tot i que ben aviat, utilitzant el llevat Saccharomyces cerevisiae com a model d’estudi, es va establir que frataxina tenia una relació amb el metabolisme del ferro al mitocondri (Babcock et al., 1997).
Al llarg d’aquests anys s’han proposat diferents funcions per a frataxina, les quals giren principalment al voltant del metabolisme del ferro i el control de l’estrès oxidatiu al mitocondri.
1.2.1.
Emmagatzematge de Ferro
Una de les funcions que s’ha proposat per frataxina és que aquesta podria funcionar com una xaperona i emmagatzemadora de ferro. En treballs realitzats principalment pel grup de la Dra. Isaya, es va observar que frataxina tenia l’habilitat d’interaccionar amb àtoms
de ferro en el seu estat d’oxidació Fe2+ in vitro. Aquesta interacció entre ferro i frataxina, li
13 fins a formar uns complexos d’alt pes molecular (850-1100 KDa) que emmagatzemaven ferro al seu interior (Adamec et al., 2000; Cavadini et al., 2002; Schagerlöf et al., 2008). Aquestes estructures recordaven a les mateixes que forma la proteïna ferritina, la principal proteïna encarregada de l’emmagatzematge de ferro en eucariotes superiors, així que es va proposar que frataxina podria actuar com una ferritina mitocondrial. Tot i que aquesta funció seria redundant en eucariotes superiors ja que ja existeix una ferritina mitocondrial, aquesta hipòtesi va adquirir certa força quan en estudis posteriors es va demostrar que l’expressió d’aquesta ferritina mitocondrial en llevats deficients en frataxina era capaç de recuperar parcialment alguns dels fenotips observats. Concretament, l’expressió de la ferritina mitocondrial reduïa l’acumulació de ferro parcialment ja que aquestes cèl·lules seguien contenint uns nivells de ferro dues vegades superiors a la soca salvatge; les cèl·lules eren més resistents a agents oxidants i es recuperaven parcialment les activitats d’enzims amb centres Fe-S (Campanella et al., 2004).
14
Figura 4. Frataxina com a xaperona i emmagatzemadora de ferro. Donat que frataxina pot interaccionar amb àtoms de ferro a través de la zona acídica de la seva seqüència, s’ha proposat que podria actuar com a xaperona de ferro. A) En condicions de baixa concentració de ferro frataxina funcionaria formant trímers i podria actuar donant ferro a diferents processos mitocondrials com la biosíntesis de grups hemo. B) Quan augmenten els nivells de ferro, els trímers de frataxina poden associar-se entre ells per formar grans oligòmers que oxidarien el ferro i l’emmagatzemarien a l’interior evitant-ne així la toxicitat de forma semblant al que faria una ferritina (Park et al., 2003).
1.2.2.
Control de l’estrès oxidatiu i la generació de ROS
Un dels fenotips característics de la deficiència de frataxina en molts dels models d’estudi utilitzats és la sensibilitat a agents oxidants, el que revela una situació d’estrès oxidatiu en aquestes cèl·lules (Babcock et al., 1997; Gabrielli et al., 2012; Obis et al., 2014; Vázquez-Manrique et al., 2006; Wong et al., 1999). Donat que frataxina té l’habilitat
d’interaccionar i d’alguna manera actuar com a quelant de Fe2+, un metall altament actiu
a nivell redox, es va proposar que frataxina podria regular l’estrès oxidatiu a través de limitar la biodisponibilitat de ferro. Per tant, a través de la unió i la posterior oxidació dels
àtoms de Fe2+ a Fe3+ per part de frataxina s’evitaria la formació de noves espècies
reactives de l’oxigen a través de la reacció de Fenton ja que frataxina evitaria que hi
hagués Fe2+ lliure (O’Neill et al. 2005; Gakh et al. 2006). En suport d’aquesta hipòtesi, cal
apuntar que s’ha demostrat que molts dels fenotips observats en deficiència de frataxina, incloent-hi la pèrdua d’enzims amb centres Fe-S, pot recuperar-se a través de reduir l’estrès oxidatiu ja sigui afegint quelants de ferro per reduir la disponibilitat d’aquest
[image:40.595.77.486.82.218.2]15 dismutasa (Irazusta et al., 2006; Wong et al., 1999). En altres experiments realitzats en Drosophila melanogaster, també s’ha demostrat que les mosques deficients en frataxina
són hipersensibles a peròxid d’hidrogen, i que la sobreexpressió d’enzims antioxidants com catalasa i la peroxiredoxina mitocondrial en milloren la supervivència (Anderson et al., 2008).
1.2.3.
Frataxina a la cadena de transport electrònic
A fi de definir la funció de frataxina a la cèl·lula s’han realitzat nombrosos estudis d’interacció. En un d’aquests estudis realitzat també en S. cerevisiae, es varen identificar diverses interaccions de frataxina amb proteïnes de la cadena de transport electrònic. Entre les proteïnes identificades, varen aparèixer les proteïnes Sdh1 i Sdh2 les quals són membres del complex II de la cadena de transport electrònic, així com Ypr004c (homòloga
de la ETF-α) i Ygr207c (homòloga de la proteïna ETF-β) també implicades en la
transferència d’electrons a la ubiquinona mitocondrial (González-Cabo et al., 2005). Aquestes interaccions per tant, suggerien que frataxina podria jugar algun paper a la cadena de transport electrònic. Tot i aquest estudi, el rol de frataxina en aquest procés no està clar i altres estudis on s’ha analitzat la composició dels supercomplexes mitocondrials no s’ha arribat a verificar la presència de frataxina en les condicions analitzades (Lapuente-Brun et al., 2013), el que indicaria que la interacció de frataxina amb la cadena de transport electrònic és una interacció dèbil un fet que suggeriria un paper secundari d’aquesta proteïna.
1.2.4.
Frataxina en la biosíntesi de grups hemo i centres Fe-S
16
amb àtoms de ferro; c) diversos estudis han mostrat l’habilitat de frataxina per interaccionar amb la ferroquelatasa, l’últim enzim en la biosíntesi de grups hemo i encarregat d’introduir el ferro a la protoporfirina IX. També s’han mostrat interaccions amb les proteïnes que formen el complex principal de la biosíntesi de centres Fe-S com són Isu1 i la desulfurasa Nfs1.
Biosíntesi de grups hemo
La incorporació de l’àtom de ferro a la protoporfirina IX és l’últim pas en la biosíntesi de grups hemo. Aquest pas està catalitzat per l’enzim ferroquelatasa, però no està massa
clar com obté l’àtom de ferro o qui li proporciona ja que el Fe2+ no circula lliure per la
cèl·lula. En estudis in vitro, es va demostrar que existia una interacció física entre
17 Biosíntesi de centres Fe-S
A més d’interaccionar amb ferroquelatasa, frataxina també interacciona amb les proteïnes que formen la maquinària central de biosíntesi de centres Fe-S, concretament amb les proteïnes Isu1, Nfs1, i Isd11. Aquesta interacció, facilita la incorporació de ferro sobre Isu1, la proteïna bastida on es sintetitzen els clústers Fe-S, el que va suggerir en un principi que frataxina podria actuar com a donador de ferro també en la biosíntesi d’aquests centres (Gerber et al., 2003). No obstant, si frataxina fos una proteïna essencial en aquest procés la pèrdua de les proteïnes que contenen centres ferro-sofre hauria de ser el fenotip principal en models de deficiència de frataxina però diferents estudis, tan en llevat com en eucariotes superiors, han mostrat que aquest seria un fenotip secundari (Irazusta et al., 2006; Moreno-Cermeño et al., 2010; Navarro et al., 2015; Obis et al., 2014)
Recentment, s’ha suggerit que frataxina participaria en la biosíntesi de centres Fe-S com a regulador al·lostèric i no com a donador de ferro de forma que el seu paper en el procés
no seria essencial. En treballs realitzats in vitro amb la proteïna CyaY (homòloga
bacteriana de frataxina), es va demostrar que aquesta tenia un efecte inhibidor sobre la producció de centres Fe-S. Aquest efecte s’incrementa a més concentració de ferro en el que els autors van descriure com una regulació per a adaptar la producció d’aquests cofactors al nombre d’acceptors finals (Adinolfi et al., 2009). Per contra, estudis realitzats amb les proteïnes humanes varen demostrar que frataxina tindria un efecte estimulant en la producció de centres Fe-S a través d’afavorir l’activitat de la desulfurasa (Bridwell-Rabb et al., 2014; Tsai & Barondeau, 2010).
18
Figura 5. Mecanisme de regulació al·lostèrica de frataxina en la biosíntesis de centres Fe-S. a) En condicions normals frataxina té una unió dèbil amb la maquinària de biosíntesi de centres Fe-S permetent que aquests es produeixin d’acord amb el nombre d’acceptors finals. B) Quan els nivells de ferro són elevats, frataxina s’uneix de forma depenent de ferro a aquesta maquinària de biosíntesis i modula l’activitat de la desulfurasa. C) En absència de frataxina l’activitat no es controla i dóna lloc a una generació excessiva i deficient de clústers que donarà lloc a estrès oxidatiu i a l’acumulació de ferro (Adinolfi et al., 2009).
1.3.
Models per a l’estudi de frataxina i l’Atàxia de Friedreich
Al llarg dels anys s’han generat diferents models per a l’estudi de la funció de frataxina i els fenotips derivats del seu dèficit. Entre aquests, podem trobar models cel·lulars que
van des dels llevats S. cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe, fins a models obtinguts a
19
1.3.1.
Models cel·lulars
El llevat com model
Els primers estudis adreçats a identificar la possible funció de frataxina es varen realitzar
utilitzant el llevat S. cerevisiae com model d’estudi donat l’alt grau de conservació en la
proteïna frataxina. En aquest primer estudi, es va identificar la proteïna Yfh1 com l’homòloga de frataxina en llevat i se’n varen estudiar els fenotips a nivell cel·lular derivats del seu dèficit. Es va identificar Yfh1 com una proteïna mitocondrial, i es va observar que el seu dèficit provocava un augment dels sistemes de captació de ferro amb la conseqüent acumulació d’aquest metall principalment al mitocondri. Alhora, les cèl·lules deficients en Yfh1 presentaven una hipersensibilitat a agents oxidants com el peròxid d’hidrogen (Babcock et al., 1997). En estudis posteriors es va observar que les cèl·lules deficients en Yfh1 perdien activitat de proteïnes amb centres Fe-S i la respiració cel·lular es veia compromesa ja que existia un fort dany sobre el DNA mitocondrial (Rötig et al., 1997; Wilson & Roof, 1997). Estudis de complementació posteriors realitzats en Saccharomyces cerevisiae, varen demostrar que l’expressió de la frataxina humana en
llevats deficients en Yfh1, l’homòleg de frataxina en llevat, aconseguia restaurar els fenotips observats en aquests mutants (Cavadini et al., 2000) el que demostraria que la funció de frataxina també està conservada.
Utilitzant aquests mutants, s’ha pogut descriure la importància que té l’estrès oxidatiu en absència de frataxina sobre la resta de fenotips. En aquest sentit, estudis previs del nostre grup van demostrar que en deficiència de Yfh1 hi havia una pèrdua d’activitat de les superòxid dismutases deguda a una deficient assimilació de manganés. La simple addició
de Mn2+ al medi provocava una disminució en la carbonilació de proteïnes i una
recuperació d’activitat de molts enzims afectats entre els quals enzims amb centres Fe-S (Irazusta et al., 2010, 2006).
Per altra banda, també s’ha realitzat un estudi utilitzant el llevat de fissió Schizosaccharomyces pombe. En aquest estudi liderat per la Dra. Hidalgo, es va identificar
20
derivats del seu dèficit. Entre ells, es van identificar fenotips comuns amb els mutants de
S. cerevisiae: sensibilitat a agents oxidants, acumulació de ferro, un menor consum
d’oxigen i un descens en l’activitat de l’enzim aconitasa (Gabrielli et al., 2012).
Tot i els nombrosos i valuosos resultats obtinguts, la utilització dels mutants nuls ∆yfh1 i
també del mutant ∆pfh1 de S. pombe, genera un problema capital i es la pèrdua de la
cronologia dels fenotips, és a dir, no només és important saber quins fenotips tenen lloc en deficiència de frataxina sinó que és important identificar quin és o quins són els
fenotips primaris entre tots ells (Pastore & Adinolfi, 2014). En el cas dels mutants ∆yfh1 la
identificació d’aquest fenotip es fa difícil donada l’alta relació que guarden entre si els tres fenotips principals identificats en absència de frataxina: acumulació de ferro, estrès oxidatiu i pèrdua de proteïnes amb centres Fe-S.
Amb l’objectiu d’adreçar aquest problema, el nostre grup va desenvolupar un nou model
condicional de llevat on el gen YFH1 es trobava sota el control del promotor tetO7 el qual
es pot reprimir afegint doxiciclina al medi, una tetraciclina que no té cap efecte sobre el creixement del llevat. Gràcies a aquest model es va poder establir un ordre en els fenotips observats prèviament, i es van identificar com a fenotips primaris la inducció dels sistemes de captació de ferro i d’enzims antioxidants; mentre que com a fenotips secundaris apareixia el descens, tant en activitat com en els nivells de proteïna, de proteïnes que contenen centres Fe-S (Moreno-Cermeño et al., 2010).
Models cel·lulars d’eucariotes superiors
21 Respecte els primers, recentment, el nostre grup ha generat dos models basats en cultius primaris de DRGs i miòcits cardíacs de rata i interferència de frataxina amb vectors lentivirals. En el cas dels miòcits cardíacs es van identificar com a fenotips primaris de la deficiència de frataxina una alteració de la xarxa mitocondrial, una acumulació de gotes lipídiques a les cèl·lules i major sensibilitat a agents oxidants. No obstant, no es varen observar alteracions en el metabolisme del ferro ni en els enzims que contenen centres Fe-S com Aconitasa, el que apuntaria a que aquests fenotips serien un fenotip secundari igual que s’havia observat en els llevats (Obis et al., 2014). Pel que fa a les DRGs, aquest model va permetre caracteritzar el procés de neurodegeneració i mort apoptòtica d’aquestes cèl·lules que té el seu origen en una alteració de la homeòstasi del calci, un fet que va permetre obrir noves perspectives terapèutiques (Mincheva-Tashevaet al., 2014).
Un altre dels teixits més afectats en la malaltia és el pàncreas, el que deriva en una major incidència en diabetis en els pacients amb Atàxia de Friedreich que en la resta de la
població. Per estudiar els efectes derivats del dèficit de frataxina en les cèl·lules β
pancreàtiques, també es va establir un model cel·lular amb RNA d’interferència (Cnop et
al., 2012). En aquest treball, on es van utilitzar cèl·lules β pancreàtiques de rata i es va
baixar l’expressió de frataxina amb RNA d’interferència, es va identificar una menor secreció d’insulina en les cèl·lules interferides així com una major sensibilitat a diferents agents estressants que provocaven la mort per apoptosi, resultats que explicarien perquè els pacients d’atàxia de Friedreich tenen una major incidència en diabetis.
Per altra banda, s’han utilitzat múltiples models cel·lulars a través de la utilització de cèl·lules provinents de pacients d’Atàxia de Friedreich. A partir de limfòcits i fibroblasts s’han pogut obtenir diferents línies cel·lulars immortalitzades comercials les quals s’han utilitzat sovint per a comprovar resultats obtinguts amb altres models com per exemple en llevat (Bulteau et al., 2012).
22
diferenciacions a miòcits cardíacs i neurones (Hick et al., 2013). Aquests models són altament interessants donat que conserven les expansions GAA originàries dels pacients, si bé amb alguna diferència com a conseqüència de la inestabilitat de les repeticions, i permeten testar no tant sols compostos potencialment terapèutics per a revertir els fenotips observats sinó que també permeten testar compostos destinats a incrementar els nivells de frataxina a través de l’increment dels nivells d’expressió, estabilització del mRNA o altres mecanismes.
1.3.2.
Models pluricel·lulars
Models invertebrats
A fi d’analitzar la deficiència de frataxina en sistemes més complexes, s’han generat models d’estudi en Drosophila melanogaster i també en Caenorhabditis elegans.
En el cas dels models de mosca, a grans trets consisteixen en l’expressió d’un RNA de
interferència contra el gen dfh (de l’anglès, Drosophila Frataxin Homolog) (Cañizares et
23 Pel que fa als models de C. elegans, aquests també es basen en RNA de interferència per a reduir l’expressió de frataxina. Diferents estudis han mostrat diversos fenotips en aquest model entre els quals, tal com s’ha mostrat per altres models de deficiència de frataxina, major sensibilitat a agents oxidants (Vázquez-Manrique et al., 2006; Ventura et al., 2005). Tot i això, els resultats publicats, de forma contrària als obtinguts en altres models, indiquen un menor contingut de lípids, un descens en alguns enzims antioxidants com SOD2 i també una menor producció de ROS (Schiavi et al., 2015). Aquests resultats posen de relleu la dificultat d’obtenir resultats homogenis en els diferents models d’estudi de frataxina per a obtenir una idea més clara de la funció d’aquesta proteïna, donat que la seva deficiència en diferents organismes i en diferents tipus cel·lulars sembla tenir diferents efectes.
Models de ratolí
Amb l’objectiu de generar un model de mamífer per a l’estudi de la deficiència de frataxina a nivell sistèmic, s’han intentat generar diferents models de ratolí. Un problema en la generació d’aquests models és que la deleció total de frataxina provoca letalitat embrionària. Per aquest motiu s’han generat diferents ratolins en els quals s’ha introduït les repeticions GAA al gen de frataxina. Principalment es poden destacar dos models els quals han introduït les repeticions GAA sobre el gen del ratolí, que són el model KIKO (knock-in – knock-out) i el KIKI (knock-in – knock-in). La diferència entre ambdós models es que el model KIKO té modificat un al·lel amb l’expansió de triplets GAA mentre que
l’altre al·lel té una deleció, donant lloc a un fenotip FxnGAA/-. Per altra banda el model KIKI
conté als dos al·lels la inserció de de triplets GAA per tant el seu fenotip és FxnGAA/GAA.
24
nivells de frataxina. Donades aquestes circumstàncies, aquests ratolins s’estan utilitzat principalment per a l’anàlisi de compostos que reverteixin el silenciament gènic de frataxina com els iHDAC i altres drogues amb potencial terapèutic.
Finalment, també s’han desenvolupat models condicionals de teixit. Per a construir aquests models es va flanquejar l’exó 4 de frataxina amb les seqüencies loxP que són reconegudes per la recombinasa Cre. Acte seguit, aquests ratolins es creuaven amb ratolins que tenien el gen de la recombinasa Cre sota el control de diferents promotors específics per a diferents teixits. D’aquesta manera, es van desenvolupar 4 ratolins: 1 que presentava deficiència de frataxina al teixit cardíac, 2 models neuronals i un últim model on frataxina era deficient al fetge. Aquests ratolins presenten l’avantatge de poder estudiar efectes específics de teixit, però l’inconvenient de no reproduir fidelment l’alteració trobada en els pacients, ja que contràriament al que passa en l’atàxia de Friedreich, els nivells de frataxina d’aquests ratolins són pràcticament nuls en els teixits indicats.
Taula 1. Fenotips dels diferents models de ratolí. Resum d’alguns dels testos realitzats als diferents models de ratolí per a determinar-ne tant fenotips neuronals com cardíacs característics de l’atàxia de Friedreich. MCK = Model condicional cardíac, NSE i PRP models condicionals neuronals. N = test realitzat i no es varen detectar alteracions, S = test realitzat amb alteracions detectades (adaptat de Perdomini et al., 2013).
Test realitzat\Model de ratolí
KIKO/KIKI YG8R/YG22R MCK NSE PRP
Atàxia cerebel·losa i
sensorial - Rotarod - Petjades N - S - - - - - S S Defectes sensorials
- Electromiograma - - - S S
Funció cardíaca
- Ecocardiografia - - S S -
Defectes motors
- Activitat locomotora
- Test força “grip”
25
2.
El metabolisme del Ferro en
Saccharomyces cerevisiae
El ferro és el quart element més abundant a l’escorça terrestre, el que ha provocat que al llarg de l’evolució aquest metall de transició hagi estat utilitzat per un gran nombre d’organismes i avui en dia el ferro és un oligoelement essencial per pràcticament totes les formes de vida. En condicions fisiològiques, podem trobar el ferro en dos estats
d’oxidació o estats redox: una forma reduïda i soluble, Fe2+; o bé en forma oxidada i poc
soluble, Fe3+. Aquesta propietat permet que el ferro pugui ser utilitzat en un ampli
nombre de reaccions en diferents grups prostètics, com els centres Fe-S o els grups hemo,
ja que el potencial redox del parell Fe2+/Fe3+ va des de -300 fins a 700 mV, depenent del
lligant al que es trobi unit, un rang que coincideix amb el dels agents oxidants i reductors biològics (revisat a Crichton, 2001). Aquestes reaccions inclouen la cadena de transport d’electrons, el transport d’oxigen o bé la reducció de nucleòtids, pas clau en la síntesi del DNA. Aquestes mateixes característiques que fan del ferro un element molt útil per la cèl·lula també el converteixen en una arma de doble tall. El ferro lliure dins la cèl·lula pot reaccionar amb oxigen donant lloc a espècies reactives de l’oxigen que són altament perjudicials per la cèl·lula donat que poden reaccionar amb diferents macromolècules provocant la seva inactivació. Per aquest motiu, tant la captació, com l’emmagatzematge i la distribució del ferro dins la cèl·lula són processos que han de ser minuciosament controlats.
26
2.1.
Biosíntesi de centres Fe-S
Tant en llevats com en bacteris o eucariotes superiors la biosíntesi de centres Fe-S juga un paper central en la regulació del metabolisme del ferro. Aquest és un procés altament conservat al llarg de la evolució i els productes generats en aquesta reacció, els clústers Fe-S, són cofactors essencials per a moltes proteïnes i permeten que moltes reaccions cel·lulars puguin tenir lloc. La biosíntesi de centres Fe-S s’ha estudiat amb un alt nivell de detall utilitzant S. cerevisiae com a model el que ha permès entendre millor aquest procés i identificar-ne un gran nombre de proteïnes que en formen part.
La biosíntesi de centres Fe-S té lloc principalment al mitocondri i en podem diferenciar 3 processos principals: a) la biosíntesis dels clústers sobre la proteïna-bastida Isu1, b) la transferència dels clústers a les apo-proteïnes receptores, i c) l’exportació d’un component suposadament format de glutatió i sofre que servirà per generar els clústers per a les proteïnes citosòliques a través de la maquinària citosòlica CIA (de l’anglès, Cytosolic Iron-sulfur Assembly machinery) (Lill et al., 2012).
2.1.1.
Síntesis
de novo
de centres 2Fe-2S sobre Isu1
27 sobre una cisteïna de Isu1 formant un nou persulfit. Per a la formació del clúster, el
persulfit format sobre les cisteïnes de Isu1 s’ha de reduir a S2- pel que es necessiten
electrons. Aquests electrons s’obtenen del NAD(P)H en una reacció catalitzada per un complex format per dues proteïnes: la ferredoxina Yah1 i la ferredoxina reductasa Arh1 (Webert et al., 2014). Finalment, s’incorpora el ferro sobre Isu1 per a la formació final del centre 2Fe-2S que posteriorment serà transferit a les proteïnes receptores. En aquest procés d’incorporació del ferro, s’han identificat els transportadors Mrs3 i Mrs4 com els responsables de l’import de ferro del citosol al mitocondri (Mühlenhoff et al. 2003; Froschauer et al. 2009) però no es sap exactament com aquest metall arriba fins a Isu1. Tot i que s’ha suggerit que frataxina podria ser el donador de ferro en aquest procés donada la seva habilitat d’interaccionar amb àtoms de ferro, aquest paper no està del tot clar. Recentment, s’ha suggerit que frataxina podria actuar com un regulador al·lostèric de la formació de clústers el que suposa que no tindria un paper essencial en aquest procés i per tant l’exclouria com a candidata a ser el donador de ferro (Adinolfi et al., 2009). D’acord amb aquesta hipòtesi, s’ha mostrat com un mutant puntual de Isu1 (M107I) reverteix els fenotips derivats de la manca de frataxina demostrant així que Yfh1 és dispensable per a la biosíntesi dels clústers (Yoon et al., 2012). El mecanisme proposat pel qual aquesta mutació permet prescindir de Yfh1 és precisament una regulació al·lostèrica sobre la desulfurasa Nfs1 produïda per aquesta mutació que seria similar a l’efecte que podria tenir Yfh1 (Pandey et al., 2013).
2.1.2.
Transferència dels clústers a les apo-proteïnes receptores
28
29 Figura 6. Biosíntesi de centres Fe-S al mitocondri. La biosíntesi de centres Fe-S té lloc al mitocondri i se’n diferencien 3 parts principals. 1) La biosíntesi de novo de centres 2Fe-2S sobre Isu1, en aquest procés participen la desulfurasa Nfs1 i la seva proteïna accessòria Isd11 que aporten el sulfur obtingut a partir de l’aminoàcid cisteïna; els transportadors Mrs3/4 i frataxina que aportarien el ferro; i finalment la ferredoxina i la ferredoxina reductasa (Arh1 i Yah1) aporten els electrons necessaris per al procés. 2) Per a la transferència dels centres des de Isu1 fins a les apo-proteïnes receptores participen les xaperones Jac1 i Ssq1, que catalitzen el pas del centre 2Fe-2S des de Isu1 fins a la proteïna Grx5 en un procés que depèn d’ATP. La proteïna Mge1 intercanvia el ADP resultant de la reacció per ATP podent així començar un nou cicle. 3) Des de Grx5 existeixen tota una sèrie de branques per a la maduració dels diferents clústers (extret de Lill et al., 2015)
2.1.3.
Maquinària de síntesi citosòlica (CIA)
[image:55.595.97.517.74.357.2]30
31 Figura 7. Maquinària citosòlica de biosíntesi de clústers Fe-S (CIA). En un procés que depèn de la síntesi dels centres al mitocondri, tot comença amb l’exportació d’un compost X-S que conté glutatió i sofre per part del transportador Atm1. 1) Un cop al citosol aquest compost serveix a les proteïnes Cfd1 i Nbp35 per a començar la síntesi dels centres. En aquest procés el complex format per les proteïnes Dre2 i Tah18 aporta el poder reductor. Es desconeix d’on surt el ferro necessari tot i que es creu que la proteïna Grx3 participa en aquest procés. 2) Finalment, el centre sintetitzat sobre les proteïnes-bastida Cfd1 i Nbp35 es transfereix a les proteïnes receptores a través d’una sèrie de proteïnes que participen en la transferència d’aquests clústers (Nar1, Cia1, Cia2 i Mms19) (extret de Lill, Srinivasan, & Mühlenhoff, 2014)
2.2.
Regulació transcripcional del metabolisme del ferro: els regulons YAP5 i
AFT1
32
[image:58.595.88.489.155.393.2]de gens el qual regula se’l denomina reguló del ferro o reguló AFT1 (Yamaguchi-Iwai et al., 1996).
Figura 8. Regulació transcripcional del metabolisme del ferro en S. cerevisiae. En condicions de suficiència de ferro, es produeixen centres Fe-S al mitocondri que serveixen com a senyalitzadors de la regulació transcripcional del metabolisme del ferro. En aquesta situació, per una banda s’activa el reguló Yap5 que promou l’emmagatzematge de ferro a través de l’expressió del gen CCC1. Per altra banda, s’inhibeix l’activitat del reguló Aft1 que es manté al citosol fent impossible l’expressió dels gens que formen el reguló del ferro. Els detalls de cada regulació es troben al text.
2.2.1.
El reguló YAP5
33 família Yap els quals modulen l’expressió de diferents gens en diferents situacions d’estrès (Li et al., 2008). Posteriorment a la identificació d’aquest factor transcripcional, es van dur a terme estudis transcriptòmics per a identificar més gens regulats per Yap5 i que formessin part de la resposta a alts nivells de ferro. Tot i que no s’han identificat un gran nombre de gens regulats directament per Yap5, a banda de CCC1 es va identificar els gens de la glutarredoxina 4 (GRX4) i el gen TYW1 relacionat amb la síntesi de tRNAs (Li et al., 2011; Pimentel et al., 2012). La troballa de que l’expressió de GRX4 està regulada per Yap5 és altament interessant ja que permet establir una relació directe entre la resposta a alts nivells de ferro, regulada per Yap5, i la resposta a baixos nivells de ferro, regulada per Aft1; ja que la localització de Aft1, i per tant la seva activitat, està regulada entre altres proteïnes per Grx4 (Pujol-Carrion et al., 2006). Per tant, en condicions on els nivells de ferro són elevats, s’indueix Grx4 i aquesta inhibiria l’activitat de Aft1 promovent d’aquesta manera que no s’indueixin els gens regulats per aquest factor de transcripció.
34
2.2.2.
El reguló del ferro o reguló AFT1
A banda del reguló Yap5, la resposta més estudiada en llevat és la que es dóna en condicions de baixa biodisponibilitat de ferro. En aquestes condicions, S. cerevisiae activa una sèrie de gens denominats en conjunt com el reguló del ferro activats pel factor transcripcional Aft1 i en menor mesura Aft2 (Yamaguchi-Iwai et al., 1996). Aquesta resposta té com objectiu incrementar la biodisponibilitat de ferro a la cèl·lula a través d’induir la captació de ferro amb transportadors d’alta afinitat, la mobilització de reserves de la vacuola i una remodelació metabòlica que té com a objectiu optimitzar l’ús del ferro a la cèl·lula. Aquests objectius es descriuen a continuació.
Taula 2. Gens regulats pels factors transcripcionals Aft1 i Aft2. Resum dels gens regulats per Aft1 i Aft2 que formen el reguló del ferro i pels quals s’ha demostrat directament aquesta relació. Els gens s’han agrupat per funcions independentment de l’orgànul on duen a terme la seva funció (adaptat de Rutherford & Bird, 2004).
Funció Gens
Transportadors FET4, FET5, FTR1, FTH1, SMF3, MRS4, CCC2, COT1
Ferrooxidases FET3, FET5
Metaloreductases FRE1, FRE2, FRE3, FRE4, FRE5, FRE6
Proteïnes de la paret cel·lular FIT1, FIT2, FIT3
Transport de sideròfors ARN1, ARN2, ARN3, ARN4
Biosíntesi de centres Fe-S ISU1, ISU2
35
2.2.2.1.
Sistemes de captació de ferro
El primer punt que han de resoldre els llevats referent al ferro és la seva captació donat que la gran majoria del ferro disponible al medi es troba en la seva forma més insoluble
Fe3+. Per a aquest propòsit el llevat disposa de diferents mecanismes de captació de ferro,
els quals els podem dividir principalment en dos grans blocs: a) la via no reductiva i b) la via reductiva (Lesuisse & Labbe, 1989).
La via no reductiva, com el seu propi nom indica, implica l’assimilació de ferro en estat
oxidat sense necessitat de reduir-lo a Fe2+. Aquesta via depèn de la captació de petites
molècules orgàniques, conegudes com sideròfors, que poden solubilitzar el ferro i afavorir-ne la captació per part de la cèl·lula. Aquests sideròfors, que no són sintetitzats pel llevat sinó per altres microorganismes que puguin compartir-ne l’hàbitat, són reconeguts per una sèrie d’enzims i cadascun d’ells és específic d’un sideròfor o d’una família concreta.
Per altra banda, trobem la via reductiva la qual implica un primer pas de reducció de Fe3+
a Fe2+ i la posterior captació d’aquests àtoms de ferro. Aquesta reacció està mitjançada
per una sèrie de ferrireductases, principalment Fre1-2, tot i que n’existeixen més homòlegs, que es localitzen a la membrana plasmàtica. Aquestes proteïnes tenen uns nivells d’expressió basals però la seva expressió augmenta en deficiència de ferro a través de l’activació d’Aft1. D’aquesta forma, el ferro reduït es pot captar per diferents canals com Fet4 i Smf1 que no són específics de ferro ja que també poden transportar altres metalls divalents (Chen et al., 1999; Dix et al., 1997). Aquests transportadors també es coneixen com el sistema de baixa afinitat. Dins la via reductiva, trobem el sistema de captació de ferro d’alta afinitat format per la ferrooxidasa Fet3 i la proteïna transportadora Ftr1. Juntes, aquestes dues proteïnes agafen ferro reduït, Fet3 l’oxida de
nou a Fe3+ i acte seguit la proteïna Ftr1 el transporta cap al citosol en una reacció
acoblada definida com iron channeling (Kwok et al., 2006).
36
d’alta afinitat, així com les reductases de la membrana plasmàtica i les proteïnes que formen la via no reductiva si que estan altament regulats per Aft1 (Taula 2).
Una altra forma d’obtenir ferro i que aquest pugui utilitzar-se a la cèl·lula ràpidament, és la mobilització de les reserves de la vacuola. De la mateixa manera que passa a la membrana plasmàtica, existeix un procés idèntic a la part interna de la membrana de la vacuola a fi de mobilitzar aquestes reserves. En aquest cas, Aft1 activa l’expressió de la reductasa FRE6 i també dels gens FET5 i FTH1 els quals realitzen la mateixa funció que Fet3 i Ftr1 a la membrana plasmàtica permetent així que es mobilitzi el ferro cap al citosol (Urbanowski & Piper, 1999).
2.2.2.2.
Remodelació metabòlica en situacions de dèficit de ferro
Amb la finalitat d’optimitzar els recursos de ferro en una situació de baixa disponibilitat
d’aquest metall, S. cerevisiae promou una dràstica regulació metabòlica. Aquesta
remodelació la duen a terme mitjançant l’expressió de proteïnes regulades per Aft1, Cth1 i Cth2, essent aquesta última la més rellevant. Aquestes proteïnes s’uneixen a uns motius
denominats AREs (de l’anglès, AU Rich Elements) als extrems 3’-UTR dels mRNAs de les
seves dianes. La unió d’aquestes proteïnes llurs mRNAs diana en promou la seva degradació a través del reclutament de l’helicasa tal i com s’ha demostrat pel mRNA de SDH4, una de les dianes de Cth2 (Pedro-Segura et al., 2008).
37 transport electrònic, el que suposa una parada immediata del creixement. Aquest mecanisme de regulació s’aconsegueix gràcies a una regulació creuada que existeix entre Cth1 i Cth2 donat que els mRNAs d’ambdues proteïnes contenen també motius ARE (Puig et al., 2008). Aquesta regulació creuada, que també pot ser auto-regulació, alhora permet que quan es restableixen els nivells de ferro la adaptació de la cèl·lula sigui més ràpida (Martínez-Pastor et al., 2013).
