Discusión general
FIJADO / FRESCO / CONGELADO
Nonato: Neonato:
Sexo: Peso: Sexo:
Longitud coronilla-rabadilla: Peso:
Longitud de fémur:
Edad: Diámetro biparietal:
Profundidad de tórax: Sano: Enfermo: Muerto:
Longitud coronilla-punta cola
Edad gestacional estimada; Signos:
Cordón umbilical:
Longitud: Ancho:
Presencia de fibra: si no Observaciones:
165 Anexo 2
Coloración de rutina: hematoxilina-eosina Protocolo
1- Sumergir los cortes en hematoxilina de Gill 5´ 2- Viraje en agua corriente, cambiando el agua 3 veces 3- Sumergir los cortes en eosina al 2% 2´
4- Lavar con agua corriente para detener la acción del colorante 5- Secado en estufa a 40º mínimo 20´
1- Deshidratación en bacteria de etanol de graduación creciente (70º, 80º, 96º, 96º, 100º, 100º) 1´ en cada uno.
6- Aclarado (xileno 1´) 7- Montaje
Resultados:
Los núcleos se tiñen color azul con la hematoxilina y los citoplasmas de color rosado con la eosina.
166 Anexo 3
Coloraciones especiales: Coloración tricrómica de Masson Protocolo
1- Si las muestras se fijaron en formol, pre tratar con Bouin en estufa a 56 ° 1 h o toda la noche a temperatura ambiente. Enjuagar con agua corriente hasta retirar el color amarillo y
enjuagar con agua destilada. Omitir si se fijó en Bouin.
2- Teñir con hematoxilina de Weigert 10´. Lavar con agua corriente hasta que vire y enjuagar con agua destilada.
3- Teñir con Fucsina ácida + escarlata de Biebrich-punzó de xilidina 15´. Enjuagar con agua destilada
4- Diferenciar con Ácido fosfotúngstico + fosfomolíbdico 10´. Enjuagar con agua destilada 5- Contrastar con Azul de anilina (o fast green) 10´
6- Diferenciar con ácido acético al 1% 1-3 ´
Soluciones:
- Diferenciación: Si se utiliza azul de anilina:
2,5 gr de ácido fosfotúngstico+2,5 gr de ácido fosfomolíbdico en 100 ml de agua destilada. Si se utiliza fast green: 5 gr de ácido fosfotúngstico en 100 ml de agua destilada.
- Azul de anilina: 2,5% en ácido acético al 2%
- Solución Bouin
Solución acuosa saturada de ácido pícrico 75 ml Formol al 10% 20 ml
167 Resultados:
El tejido conectivo se tiñe color verde brillante (fast green) o azul (azul de anilina), el citoplasma y las fibras musculares de color rojo, y los núcleos de color azul.
168 Anexo 4
Coloraciones especiales: Técnica de impregnación argéntica de Gomori Protocolo
1- Oxidar los cortes con permanganato de potasio al 1% 5´ 2- Lavar con agua corriente
3- Decolorar con metabisulfito de potasio 1´ (hasta la desaparición completa del color marrón) 4- Lavar en agua corriente
5- Sensibilizar con alumbre férrico amónico al 2% 5´
6- Lavar en agua corriente 5´. Realizar dos lavados en agua destilada. 7- Impregnar con la solución de plata durante 5´
8- Lavar con agua destilada 9- Reducir con formol al 10% 1´ 10-Lavar con agua corriente
Soluciones:
- De plata amoniacal de Gomori:
Mezclar 1 ml de nitrato de plata al 10% con 0,1 ml de hidróxido de sodio al 10%. Se formará un precipitado negro de óxido de plata que se reducirá con el agregado de amoníaco puro, gota a gota, hasta la desaparición del precipitado al agitar la solución. Se deja reposar 15´, se filtra y se agrega igual cantidad de agua destilada.
169 Anexo 5
Coloraciones especiales: Reacción del ácido periódico de Schiff (PAS) Protocolo
1- Oxidar los cortes con ácido periódico al 1% durante 10´ 2- Lavar con agua destilada
3- Colocar el reactivo de Schiff 5´ (tiempo ajustado para el hígado)
(Controlar la adquisición de un tono de rosado a fucsia sobre superficie blanca) 4- Virar en agua corriente hasta que el corte no desprenda color
5- Contraste nuclear con hematoxilina 6- Virar en agua corriente
7- Montaje Soluciones: - Reactivo de Schiff Fucsina básica 2g Bisulfito de potasio 4g Agua destilada 200 ml Ácido clorhídrico 1N 40 ml
Hervir el agua destilada, retirar del fuego y agregar la fucsina básica. Mezclar, enfriar bruscamente a 60 ºC y agregar el ácido clorhídrico. Tapar herméticamente y dejar madurar a temperatura ambiente 24 Hs. Conservar en heladera.
Resultados:
170 Anexo 6
Técnicas de Inmunohistoquímica Protocolo 1
La identificación de la expresión de vimentina (Vim), desmina (Des), pancitoqueratina (panCK), c-Kit y antígeno de proliferación celular (PCNA) se efectuaron en forma manual en el Laboratorio de Patología General de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata (Argentina) (Fig. 1).
Pasos previos:
- Colocar los portaobjetos en estufa a 37,4ºC overnight, con el objeto de favorecer la desparafinización.
- Preparación de las diluciones de los anticuerpos: C-Kit: 1/50
PCNA: 1/3000
Los anticuerpos anti-vimentina, anti-desmina y anti-panCK se comercializan listos para ser utilizados.
2- Desparafinado: xileno 12´x 2 3- Hidratación: etanol 100º 5´x 2
4- Inactivación de la peroxidasa endógena: peróxido de hidrógeno en metanol 3% 30´ 5- Hidratación: etanol 96º x 2, 70º 3´en cada uno
6- Lavado en PBS: 5´x 3 sin agitar
7- Recuperación antigénica: se realiza en horno a microondas a 750 W. Se colocan los portaobjetos en cubetas Coplin, en solución de buffer citrato 5´; se completa el volumen evaporado con agua destilada y se aplican 5´más. Los cortes se dejan enfriar en el buffer citrato, pudiéndose agregar solución de PBS
171
9- Inactivación de uniones inespecíficas: incubación en cámara húmeda en albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS 30´a temperatura ambiente. No se enjuaga y se deja secar parcialmente
10-Incubación con el anticuerpo primario en cámara húmeda en la heladera overnight 11- Enjuague en PBS 5´x 3
12-Incubación con el anticuerpo secundario: en cámara húmeda 20´a temperatura ambiente Los anticuerpos monoclonales (Vim, Des, PCNA) se incuban con Envision Mouse DAKO® Los anticuerpos policlonales (panCK, c-Kit) se incuban con Envision Rabbit DAKO® 13- Enjuague en PBS 5´x3. Escurrir y secar
14- Revelado: diaminobencidina (DAB Kit Vector DAKO®)
15- Corte de la reacción en agua corriente y posterior enjuague con agua destilada
16-Coloración nuclear con hematoxilina de Gill 20´´. Virar en agua corriente y enjuagar con agua destilada
17-Deshidratar en batería creciente de etanol (70º, 80º, 96º, 96º, 100º, 100º), aclarar con xileno 1´
18-Montaje
Figura 1- Técnica de inmunohistoquímica manual.
La identificación de la expresión de alfa 1fetoproteina (α1fp), Hepatocyte Dako®, CD68, proteína ácida glial fibrilar (GFAP), factor de Von Willebrand (VWF), mieloperoxidasa (Mpx), Ki- 67, c-Kit, se llevó a cabo en el Centro de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza (España).
172 Protocolo 2
Pasos previos: colocar los portaobjetos en estufa a 56 ºC overnight, con el objeto de favorecer la desparafinización.
- Detección de la expresión de α1fp, Hepatocyte®, CD68, VWF, Mpx, Ki-67 y c-Kit Preparación de los anticuerpos:
El anticuerpo c-Kit se utilizó en las concentraciones: 1/100, 1/400, 1/600, 1/1200
Los anticuerpos α1fp, Hepatocyte®, CD68, VWF, Mpx y Ki-67 se comercializan listos para ser utilizados. 1- Desparafinar: - Xilol: 5´ x 2 veces - Etanol 99%: 5´ x 2 - Etanol 96%: 3´ - Etanol 70%: 3´
2- Lavar las preparaciones con agua destilada
3- Recuperación antigénica
Incubación en DAKO® PT LINK (Fig. 1)
-α1fp, Hepatocyte®, CD68, VWF, Mpx, c-Kit: en buffer Tris/EDTA (Target Retrieval Solucion K8004 DAKO®)PH 9, 20´ a 96 ºC (incluye enfriamiento).
-Ki-67: en buffer citrato pH: 6,1 (Target Retrieval Solucion, low pH K8005 DAKO®), 20´ a 96 ºC (incluye enfriamiento)
Realizar en DAKO Autostainer Link 48 (DAKO® Japón) (Fig. 2): - Pasar las preparaciones a Wash Buffer DAKO® 5´
173
- Cubrir la muestra con Peroxidase blocking solution DAKO® durante 5´ 5- Lavado con Wash buffer DAKO®
6- Incubación con el anticuerpo primario: 30´ a temperatura ambiente. 7- Lavado con Wash buffer DAKO®
8- Incubación con el polímero marcado:
- Hepatocyte®, CD 68, Ki-67: Incubar con Envision Mouse DAKO® 30´ a temperatura ambiente. - α1fp, VWF, Mpx, c-Kit: Incubar con Envision Rabbit DAKO® 30´ a temperatura ambiente. 9- Lavado con Wash buffer DAKO®
10- Revelado con DAB Plus (EnVision kit DAKO®)
- Incubar con DAB: 10´ (1 gota de cromógeno por ml de buffer) 11- Lavado: agua destilada
12- Tinción
- Teñir con hematoxilina: 5´ - Lavado: agua destilada En forma manual realizar: 13) Deshidratación: - Alcohol 70º: inmersión (x 3) - Alcohol 96º: inmersión (x 3) - Alcohol 100º: inmersión (x 3) - Alcohol 100º: inmersión (x 3) 14) Aclarado
174 - Xilol: inmersión (x 3)
- Xilol: inmersión
14- Montar con DPX DAKO® Reactivos
DAKO®
Antibody diluent: S2022
Peroxidase blocking solution: S2023 Diaminobencidina (DAB): K3468 Hematoxilina: S2020.
Wash Buffer: S-3006
Figura 2- Técnica de inmunohistoquímica automática. A- Módulo de recuperación antigénica PT-Link DAKO®; B- Autostainer Link 48 DAKO®.
Protocolo 3
- Detección de la expresión de GFAP
Secciones: 3-5µ en portaobjetos positivados. Secarlas overnight a 56º El anticuerpo GFAP se utilizó en la concentración 1/500
Desparafinización:
175 Xileno: 5´ x 2
Etanol 100º: 5´ x 2 Etanol 96º: 3´ Etanol 70º: 3´
Pasar las preparaciones a agua destilada. No dejar que se sequen a partir de este paso No requiere recuperación antigénica
En el autostainer Link 48 DAKO®:
Cubrir la muestra en solución de peroxidasa 5´
Inmersión en solución al 3% de peróxido de hidrógeno en metanol: 15´ Lavado: solución de Tris tamponada (TBS)
Incubación con el anticuerpo primario:
Incubar con 150-200 µl del Ac GFAP (dilución 1/500): 30´ a RT Lavado: TBS
Incubación con el polímero (EN Vision Kit DAKO®)
Incubar con EN Vision rabbit DAKO® (150-200 µl) 30´ a RT Lavado: TBS
Revelado con DAB Plus (EN Vision Kit DAKO®)
Incubar con DAB: 10 min (preparar DAB cada vez que se vaya a utilizar) Lavado con agua destilada
Teñir con hematoxilina DAKO®: 5´ Lavado con agua destilada
Deshidratación:
Alchol 70º 3 inmersiones Alcohol 96º 3 inmersiones Alcohol 100º 3 inmersiones
176 Alcohol 100º 3 inmersiones Aclarado: Xileno 3 inmersiones Xileno 5´ Montaje:
177 Anexo 7
Técnicas de Lectinhistoquímica
Protocolo
1- Desparafinado: xileno 12´ x 2. Escurrir 2- Hidratación: alcohol etílico 100º 5´ x 2
3- Inactivación de la peroxidasa endógena: peróxido de hidrógeno al 3% en metanol 3% 30´ 4- Continuación de la hidratación: pasajes en alcohol etílico 96º (5´ x 2) 80º (5´) 70º (5´) 5- Lavado en PBS 3´ con agitador, luego dos lavados más sin agitador
6- Secado cuidadoso con papel evitando barrer los tejidos
7- Inactivación de uniones inespecíficas: BSA al 1% en PBS 20-30´. Escurrir
8- Incubación con las lectinas en cámara húmeda a 4ºC en heladera overnight. Escurrir 9- Lavado de cada lectina por separado en PBS 5´ x 3
10-Amplificación: Método Streptavidin biotina conjugada con peroxidasa 30´ 11-Lavado en PBS 5 min x3
12-Revelado: diaminobencidina (DAB) DAKO® 13- Corte de la reacción en agua destilada
14-Coloración nuclear con hematoxilina de Gill 20´´. Virar en agua corriente y enjuagar con agua destilada
15-Deshidratar: en batería creciente de etanol 1´ (70º, 80º, 96º, 96º, 100º, 100º) 16-Aclarar: xileno 1´