Función de la ruta FA/BRCA

Dentro de las funciones que tiene la ruta FA/BRCA está la coordinación y regulación de diferentes actividades de reparación para diferentes vías de reparación clásicas, entre las cuales se encuentran las vías de reparación de incisión de nucleótidos, de TLS, de RH. Estas vías actúan en su respectivo orden para la reparación de ICLs (Moldovan & D’Andrea, 2009). Adicionalmente, los resultados de diversos estudios han mostrado que la ruta FA/BRCA tiene una función importante en la regulación negativa de la vía de reparación de NHEJ (Adamo et al., 2010; Pace et al., 2010; Patel et al., 2011).

Regulación de la reparación por el paso de incisión de nucleótidos de la ruta FA/BRCA

En cuanto a la regulación de la reparación por incisión de nucleótidos de los ICLs, la proteína FANCP/SLX4 resulta ser esencial. FANCP funciona como modulador y cofactor para tres nucleasas SLX1, MUS81-EME1 y XPF-ERCC1,

17 siendo esta última la más importante para la resistencia a ICLs, dirigiendo el proceso enzimático sobre el sitio del daño (Kim et al., 2013). Una reciente publicación en la que se identificó dos pacientes AF con mutaciones en XPF/FANCQ deja en evidencia el importante papel que cumple XPF-ERCC1 en la reparación de ICLs en el DNA (Bogliolo et al., 2013).

Por otra parte se ha visto que para la reparación de ICLs es esencial la interacción del dominio UBZ4 de FANCP con FANCD2 monoubiquitinado (FANCD2-Ub) (Yamamoto et al., 2011). En recientes publicaciones sobre FAN1 se evidenció que esta proteína podía ser reclutada por FANCD-Ub en el sitio del daño por medio de la interacción con su dominio UBZ4 (Kratz et al., 2010; Liu et al., 2010; MacKay et al., 2010; Smogorzewska et al., 2010).

Regulación del paso de TLS de la ruta FA/BRCA

Una vez desenganchado el ICL de una de las cadenas del DNA se activa la TLS. La TLS es uno de los mecanismos celulares para la toleración del daño del DNA y reparación post-replicación, con tendencia a generar errores. La TLS a través de la actividad de polimerasas tolerantes de error, permite a las células su replicación a partir de cadenas sencillas de DNA con lesiones sin corregir (Lehmann et al., 2007). La TLS usa DNA polimerasas especializadas de baja fidelidad para sobrepasar directamente la lesión, ya que carecen de actividad correctora 3'-5' y contienen un sitio activo sin restricciones que puede acomodar a las bases distorsionadas y sus malos apareamientos (Sale et al., 2012). Estas polimerasas TLS están recubiertas y reguladas por una modificación post-transcripcional de PCNA. PCNA es una polimerasa con factor de procesividad que recubre el DNA y funciona como una plataforma móvil para la síntesis de DNA (Hoege et al., 2002; Kannouche et al., 2004; Watanabe et al., 2004). Tras la detención de replicación, el complejo ligasa ubiquitina E2- E3 asociado a RAD6-RAD18 interacciona con RPA unido a DNA de cadena sencilla y PCNA ubiquitinado (PCNA-Ub), reclutando así una TLS polimerasa en el sitio de la lesión del DNA.

Otra proteína a resaltar es USP1, la cual es una enzima DUB que regula el nivel de FANCD2-Ub (Nijman et al., 2005). USP1 se asocia con UAF1 y estimula su actividad enzimática (Cohn et al., 2007). El agotamiento de USP1 o

18 UAF1 causa hiperacumulación tanto FANCD2-Ub y PCNA. Por lo tanto, USP1 controla el estado de monoubiquitinación de estas dos importantes proteínas que trabajan en la ruta FA/BRCA y TLS (Howlett et al., 2009; Oestergaard et al., 2007). Ello sugiere que ambas rutas están coordinadas por la acción concertada de la ubiquitinación y deubiquitinación de FANCD2 y PCNA.

Regulación del paso de la RRH de la ruta FA/BRCA

Después de la incisión de la región que flanquea de la ICL en una de las cadenas de DNA, se crea un DSB como un producto intermedio del proceso de reparación del ICL. En este punto se activa la RRH, la cual utiliza la cadena de DNA homóloga restaurada por TLS como molde para reparar la otra cadena de DNA. Muchos factores de la ruta FA/BRA están implicados en la promoción directa e indirecta de la RRH. Interesantemente, la mayoría de las proteínas que interactúan posterior a la activación del complejo ID están implicadas en RH, entre estas proteínas están FANCD1/BRCA2, FANCJ/BRIP1/BACH1, FANCN/PALB2 y FANCO/RAD51C.

BRCA1 tiene un papel importante en el proceso de RRH en la reparación de ICLs, ya que promueve el recubrimiento de la cromatina por FANCD2-Ub en una etapa temprana (Bogliolo et al., 2007) y de RAD51 en una etapa posterior de la reparación del ICLs (Lu et al., 2005). La función principal de BRCA2 en la RRH es regular la localización de RAD51 en la cromatina, promoviendo el recubrimiento de DNA en cadenas sencillas recubiertas por RPA. RAD51 es la recombinasa que se une al DNA de cadena sencilla para iniciar la invasión de la cadena sencilla sobre la cadena doble de DNA durante el proceso de recombinación.

Se ha descrito que PALB2 interacciona con BRCA2 regulando su localización nuclear y su estabilidad (Xia et al., 2006). A su vez, BRCA1es un regulador de BRCA2 en respuesta al daño y PALB2 sería el puente entre estas dos proteínas (Zhang et al., 2009).

FANCJ/BRIP1 depende de BRCA1 para formar focos en el sitio del daño y dicha interacción depende de la previa fosforilación de FANCJ en la serina 990 que se produce en fase S y G2 del ciclo celular (Yu et al., 2003). FANCJ contiene un dominio helicasa DEAH, de forma que es capaz de desenrollar la

19 doble cadena de ADN moviéndose a lo largo de la hebra gracias a su capacidad de hidrolizar ATP (Cantor et al., 2001; Hiom, 2010b). FANCJ también interacciona directamente con las proteínas del complejo MutLα de MMR, MLH1 y PMS2; aunque la implicación de las proteínas de MMR en la ruta de reparación de ICLs no es clara (Ali et al., 2009).

Finalmente, mutaciones en homocigosis en el gen XRCC2, un gen de susceptibilidad a cáncer de mama, han sido identificados en un paciente AF Saudi (Shamseldin et al., 2012). Aunque de este estudio no se puede concluir que este gen sea un nuevo gen AF.

La figura 4 esquematiza los diferentes pasos implicados en la reparación de los ICLs por medio de la ruta FA/BRCA.

Figura 4. Reparación de ICLs por la ruta FA/BRCA. (A) El reconocimiento y localización en el sitio del daño por FANCM (durante la fase S) y su posterior activación del complejo nuclear AF permite activar la ruta por la FANCD2-Ub lo cual activa proteínas por debajo del complejo ID. (B) El proceso de reparación de los ICLs se da por diferentes pasos de reparación de la ruta FA/BRCA.

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Relación entre la ruta FA/BRCA y la ruta NHEJ

La ruta FA/BRCA no solo promueve la RH, sino también suprime la NHEJ, otro mecanismo de reparación de rupturas de doble cadena. Estudios llevados a cabo en paralelo por Adamo y colaboradores y Pace y colaboradores demostraron en trabajos paralelos publicados como el fenotipo AF podía ser rescatado por inhibición de la vía NHEJ (Adamo et al., 2010; Pace et al., 2010). En la figura 5 se esquematiza los efectos de los ICLs a nivel celular con una ruta FA/BRCA defectuosa.

Figura 5. Efectos de los ICLs a nivel celular con la ruta FA/BRCA defectuosa. Ante la ausencia de la actividad reparadora de la ruta FA/BRCA, el daño generado en el DNA por los ICLs puede ser reparado por NHEJ generando rupturas cromatídicas o figuras radiales a nivel cromosómico.