Identificación molecular

3.4.1 Extracción ADN

De cada cultivo monospórico se realizó la extracción de ADN utilizando una porción micelial evitando llevar demasiado agar. Se empleó el kit de extracción DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen ®, siguiendo el protocolo del fabricante

(Anexo1).

41

Falconi, C (1998). Fitopatología Práctica, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela Politécnica del Ejército. Primera Edición. Sangolqui, Ecuador.

42

Barnett, H y Hunter, B (1998). Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Cuarta edicion. The American Phytopathological Society . Pp. 188-189.

- 15 - 3.4.2 Amplificación de ADN mediante PCR

Este proceso se llevó a cabo después de haber confirmado la existencia de ADN de buena calidad (mediante electroforesis y cuantificación en el Nanodrop 2000). En la tabla 1 se indica la preparación de la mezcla para la PCR.

Tabla. 1. Preparación de soluciones para amplificar ADN mediante PCR

REACTIVO MIX 1 Phusion polimerasa 10 μl H2Odde 6,4 μl Cebador Fw 0,4 μl Cebador Rw 0,4 μl BSA 0,8 μl ADN 2 μl TOTAL 18 μl

Se utilizaron primers universales para Colletotrichum acutatum y Botrytis cinerea , se amplificó un segmento de la región intergénica con el cebador

universal ITS1 Fw (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3 '), el cual fue

combinado con el cebador ITS4 Rv (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’)

(43)_{, además se utilizaron cebadores específicos para}

Botrytis pseuocinerea, el

gen MS547 (5'-AAG GAG GAC GT TGGA AGG AT-3') y (5'-AAG TCC AGA

ATC TCG ATG TAT TTG T-3 ') (44)_{, una especie de}

Botrytis con características

morfológicas similares a la estudiada en nuestra investigación. MS547 codifica la ATP-dependiente del RNA helicasa DBP7 (referencia de genes en el genoma de B. cinerea B0510: BC1G_03202.1)

Las muestras se llevaron al termociclador Applied Biosystem programado de la siguiente manera para Colletotrichum acutatum: Desnaturalización inicial

98°C por 30s, seguida de 30 ciclos, cada ciclo consta de un paso de desnaturalización a 98°C por 10 s, anillamiento de primers 60°C por 20 s,

43

White, T. J., Bruns, T., Lee, S. & J. Taylor (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315-322. En M. Innis, D. Gelfand, J. Snisky & T. White (eds). PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego: Academic Press.

44 _{Walker, A.-S., Gautier, A., Confais, J., Martinho, D., Viaud, M., Le Pêcheur, P., Dupont, J., and Fournier,}

E. (2011). Botrytis pseudocinerea, a new cryptic species causing gray mold in French vineyards in sympatry with Botrytis cinerea. Phytopathology 101:1433-1445.

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extensión a 72°C por 30 s, una extensión final a 72°C por 7min y con una temperatura final de enfriamiento de 4°C.

En el caso de Botrytis cinerea se programó de la siguiente manera

Desnaturalización inicial 95°C por 5min, seguida de 40 ciclos, cada ciclo consta de un paso de desnaturalización a 95°C por 30 s, anillamiento de primers 62°C por 30 s, extensión a 72°C por 90 s, una extensión final a 72°C por 5min y con una temperatura final de enfriamiento de 4°C.

Los productos de PCR se verificaron por medio de electroforesis (128 V, 300 mA, 20 min) en gel de agarosa al 1%, se colocó en el primer pocillo del gel 1,5

μl de marcador molecular de 100pb y en el resto de pocillos se cargo 2 μl de cada producto de PCR combinado con 1.5 μl de azul de bromofenol y se realizó la observación en el transiluminador UV.

3.4.3 Cloning y Purificación de productos

Para realizar el cloning de los fragmentos de ADN obtenidos por PCR, se utilizó cepas bacterianas E.coli TOP10, medio solido LB (Bacto - Agar) con Kanamicina en cantidad 100mg/ μl, vector Zero Blunt TOPO PCR y el kit de

Cloning (Invitrogen) siguiendo el protocolo modificado por el grupo de micorrizas del departamento de ciencias naturales (Anexo 2).

La transformación de E. coli se realizó mediante shock térmico, utilizando 2 μl

de la mix de cloning, sometiéndose a 42°C durante 1 min. Posteriormente, las colonias sembradas y crecidas en la placa Petri se dejaron crecer en un medio de cultivo líquido LB con antibiótico durante 12 horas, para la posterior purificación , para lo cual se utilizó S.N.A.P.™ MidiPrep Kit (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante (Anexo 3).

3.4.4 Digestión enzimática

Se realizó un corte en la cadena del ADN utilizando la enzima de restricción EcoR1, (Tabla 2) incubando a 37°C durante 3 horas, luego se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% para la observación del producto

.

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Tabla. 2. Preparación de soluciones para digestión enzimática

REACTIVO MIX 1 ADN plasmídico 2,5 μl Enzima EcoR1 0,5 μl Buffer 0,5 μl H2Odde 1,5 μl TOTAL 5 μl 3.4.5 Secuenciación

Con el fin de confirmar la identidad de las especies encontradas, se recurrió al uso de técnicas de secuenciación las cuales se llevaron a cabo en un volumen total de 16 μl, cada tubo conteniendo: 1 μl Big dye® Terminador del ciclo de la secuenciación, 1 μl Cebador de Secuenciación, 2 μl de ADN plasmídico, 2 μl

de 5x Buffer y 10 μl de Agua destilada desionizada estéril. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador 3500 Genetic Analyzer Applied Biosystem. El termociclador fue programado para realizar: desnaturalización de 96o_{C durante 1 minuto, 50 ciclos de 96}o_{C por 10 segundos, la temperatura}

apropiada de anillado 60o_{C por 4 minutos.}

La purificación de la secuenciación luego de la amplificación fue realizada usando el kit BigDye XTerminator, para lo cual se utilizó: 20μl de muestra de solución SAM y 5μl del ADN amplificado, luego se aplica vortex por 30 minutos. La muestra se centrifugo por 2 minutos y 10μl del sobrenadante se usó para correr la secuencia de análisis.

Se utilizó primers universales M13-Fw (5’TGT AAA ACG ACG GCC AGT3’) y

M13-Rv ( 5’TGC CAG GAA ACA GCT ATG AC3’), para la secuencia de

nucleótidos clonados anteriormente.

3.4.5.1 Análisis de secuenciación

Las secuencias obtenidas se analizaron en VecScreen del sitio web NCBI (National Center for Biothecnology Information), un sistema para la rápida identificación de segmentos de una secuencia de ácido nucleico que puede ser

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de origen del vector de clonación, con esta herramienta se pudo identificar la secuencia apropiada y cortar lo que se encontraba contaminado por vector. Se utilizó el sitio web SMS (Sequence Manipulation Suite), herramienta Reverse complement (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_comp.html), para poder convertir la secuencia de ADN en complemento reverso.

Las secuencias identificadas se compararon con la base de GenBank en el NBCI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizando la interfaz web BLASTn.