2.7.3.2 Interaccions entre diferents metalls Acció independent

En aquest estudi, les interaccions additives, sinergístiques o antagonístiques, que es produeixen entre els diferents metalls presents en una mateixa solució, han estat avaluades mitjançant un mètode quantitatiu que consisteix en el tractament i anàlisi estadística de les dades experimentals i de les obtingudes a partir de la comparació de l’hipòtesi nul·la i la toxicitat observada, per tal de detectar estadísticament les diferències entre els grups de dades analitzats (Ince et al., 1999).

Les interaccions existents entre metalls en solucions binàries també varen ser estudiades quantitativament mitjançant una anàlisi estadística dels resultats. En global, aquestes diferències varen ser avaluades comparant (1) la toxicitat determinada experimentalment quan aquests dos metalls es troben presents en una mateixa solució (TUobs) i (2) la toxicitat esperada segons la hipòtesi nul·la del model estadístic utilitzat (TUH).

En aquest estudi, la toxicitat de les mostres es va determinar utilitzant les unitats de toxicitat (TU) descrites anteriorment. Tal i com s’ha explicat en apartats anteriors, es defineixen les unitats de toxicitat com TU=100/EC50, on la EC50 s’expressa com a percentatge de la concentració de la mostra inicial que provoca una inhibició lumínica del 50%. Així, cal remarcar, que en aquest cas, els valors obtinguts no són valors absoluts sinó valors relatius que fan referència a la concentració inicial. Així, les unitats de toxicitat d’aquestes solucions poden sumar-se, la qual cosa no podria realitzar-se amb els valors de EC50 trobats (mg/L) ja que es tracta de concentracions de dos metalls diferents.

Així, una vegada obtingudes les unitats de toxicitat de cada un dels metalls quan es troben individualment i conjuntament, es varen avaluar les diferències mitjançant una anàlisi estadística, utilitzant el test d’Student. En aquest cas, la hipòtesi nul·la del test defineix les unitats de toxicitat esperades de la mescla (TUH) com la suma de les unitats de toxicitat dels dos metalls de la mescla quan aquests es troben individualment, fenomen altrament anomenat additivitat que es representa en l’equació següent,

Ho : TUH(x + y)=TUx + TUy (Equació 9)

on TUH(x + y) són les unitats de toxicitats esperades d’una mescla que conté dos metalls (x+y)i a un pH 6.0. D’altra banda, TUx i TUy, corresponen a les unitats de toxicitat observades per a cada un dels metalls de la mescla avaluats individualment en una solució del mateix pH.

Material i mètodes 47

Una vegada definit el model estadístic a seguir, es procedeix a determinar les anomenades unitats de toxicitat diferencials (TUDiff), que es defineixen com la diferència entre les unitats de toxicitat esperades i les unitats de toxicitat observades experimentalment. Aquesta relació es defineix com,

TUDiff = TUH – TUobs (Equació 10)

on TUH són les unitats de toxicitat esperades de la mescla segons la hipòtesi nul·la del model estadístic anteriorment definit i TUobs són les unitats de toxicitat determinades experimentalment quan els dos metalls es troben conjuntament. En segon lloc, és necessària el càlcul del valor t del test de Student per cada una de les TUDiff calculades anteriorment. Així, l’estimació del valor t observat a uns determinats graus de llibertat amb un nivell de confiança del 95%, s’aconsegueix a partir de la següent equació,

t = TUDiff / SEDiff (Equació 11)

on TUDiff és la diferència de toxicitat que existeix entre els grups de dades comparats i SEDiff és la desviació estàndard d’aquesta diferència.

Per acabar, es compararan els valors de tobs i de tdf,0.05, tabulada en la taula de valors t de la distribució de Student, tenint en compte els graus de llibertat (df(SEobs)+df(SEH)) i un nivell de confiança del 95%. Així, es pot determinar si existeixen diferències significatives entre els grups de dades analitzats. Si el valor t estimat és inferior al valor t tabulat (t<tdf,0,05) podem considerar que no existeixen diferències significatives entre els dos valors comparats. En aquest cas s’acceptaria la hipòtesi nul·la i es consideraria l’existència d’una interacció additiva entre els metalls de la mescla. Si pel contrari, el valor t estimat és superior al valor t tabulat (t>tdf,0,05) podem considerar que existeixen diferències significatives entre els valors comparats. Això suposaria un rebuig de la hipòtesi nul·la, que en el nostre cas determinaria l’existència d’interaccions antagonístiques o sinergístiques.

En aquest cas, si TUDiff> 0 podem considerar que existeix un antagonisme entre els dos metalls presents en la mescla binària. Contràriament, si TUDiff<0 podem afirmar que existeix un sinergisme entre els dos metalls presents en la mescla binària. A més a més, tal i com ja s’havia dit anteriorment, és important conèixer el valor p, per tal de decidir si les diferències són estadísticament significatives. En aquest estudi, es considera que hi ha diferències estadísticament significatives si p<0,05, la qual cosa significa que l’error és inferior al 5 %.

I.2.7.4 Interaccions entre diferents espècies d’arsenat en mescles binàries

En el cas de l’arsenat, l’estudi de la toxicitat de les diferents espècies ha estat possible gràcies a la variació inversament proporcional en funció del pH de la solució on es troben de les dues espècies existents. Es coneix que en les solucions ajustades a pH 5.0 trobem aproximadament

48 Capítol 1

un 100 % de l’espècie dihidrogenarsenat i en les solucions ajustades a pH 8.0 aproximadament un 100 % de l’espècie monohidrogenarsenat. Així, les interaccions que es produeixen entre espècies presents en les solucions ajustades a pH 6.0 i 7.0, on es troben diferents proporcions de dihidrogen i monohidrogenarsenat, han pogut ésser estudiades.

Així, una vegada determinades les EC50 i les TU de les diferents espècies d’arsenat, quan aquestes es troben individualment en solució (pH 5.0 i pH 8.0), es varen avaluar estadísticament les interaccions existents entre aquestes dues espècies quan es troben conjuntament en diferents proporcions. El procediment per avaluar aquestes interaccions és el mateix que el descrit anteriorment.

En aquest cas, l’anàlisi estadística de les interaccions entre espècies d’arsenat, quan aquestes es troben en diferents proporcions en funció del pH de la solució, s’ha realitzat amb el mateix mètode utilitzat anteriorment (Apartat I.2.7.4). Nogensmenys, cal destacar certes diferències alhora d’analitzar aquestes interaccions.

En primer lloc, cal destacar que els valors EC50, a partir de les quals es calcularan les unitats de toxicitat, no s’expressen com a percentatge de la concentració inicial. A diferència de l’apartat anterior, on s’analitzaven dos metalls diferents, les EC50 s’expressen en concentracions d’arsenat (mg/L). Això és possible degut a que es tracta de diferents espècies d’un mateix metal·loide i que l’augment d’una espècies suposa la disminució de l’altre i inversament.

En segon lloc, a l’hora d’estudiar la toxicitat de diferents espècies d’un mateix element, és necessari conèixer la toxicitat de cada una de les espècies analitzades separadament. Així, la toxicitat de l’espècie dihidrogenarsenat ha estat avaluada en les solucions ajustades a pH 5.0 on es troba una proporció al voltant del 100% d’aquesta espècie. De la mateixa manera, la toxicitat de l’espècie monohidrogenarsenat ha estat avaluada en solucions ajustades a pH 8.0, on hi ha aproximadament un 100% d’aquesta espècie. Sabent això, ha estat possible calcular les unitats de toxicitat esperades (TUH) de les solucions ajustades a pH 6.0 i pH 7.0 on existeixen diferents proporcions de les espècies (x i y). En aquest cas, l’equació utilitzada es presenta a continuació,

Ho : TU H (x+y)i = %x TUx,i + %y TUy,i (Equació 12)

on %x i %y són la proporció de cada una de els espècies estudiades a un determinat pH (i) i TUx,i i TUy,i són les unitats de toxicitat corresponents de cada una de les espècies avaluades individualment en el mateix pH(i).

Resultats 49

I.3. RESULTATS

A continuació, es presenten el resultats obtinguts en aquest estudi en els articles científics publicats o en període de revisió que s’adjunten a continuació.

Per començar, es presenta un article enviat per publicació a la revista Archives of Environmental Con amination and Toxicology, en el qual es presenten les corbes dosi resposta i les concentracions llindar de diversos metalls pesants i arsènic en solucions de diferent pH obtingudes utilitzant l’assaig Microtox. En aquest article també es comparen aquestes concentracions llindar amb la normativa vigent per determinar l’eficàcia d’aquest bioassaig per detectar aquests agents agressor.

t

i t

D’altra banda, en el treball enviat per publicació a la revista Chemosphere, es presenten els resultats obtinguts de l’estudi de les interaccions que es produeixen entre metalls pesants en mescles binàries utilitzant diferents models estadístics.

Seguidament, s’inclou l’article publicat aquest mateix any a la revista Archives of Env ronmental Con amination and Toxicology, el qual recull les investigacions sobre la toxicitat de l’arsenat i l’arsenit en medis d’assaig de diferent pH sobre el bacteri Vibrio fischeri (Assaig Microtox). També s’avaluen les interaccions que es produeixen entre les diferents espècies d’arsenat presents en solució a pH 6.0 i 7.0

Article 1. Fulladosa, E and Villaescusa, I. “Patterns of metals and arsenic