Línies cel·lulars in vitro com a models biològics per a l’avaluació de la toxicitat de metalls pesants utilitzant

Introducció general 151

III.1 INTRODUCCIÓ GENERAL

La utilització de bioassaigs de toxicitat microbians no és suficient per avaluar la toxicitat de metalls pesants i altres substàncies contaminants en el medi ambient. Per determinar d’una manera fiable la nocivitat d’un metall pesant o metal·loïde és necessari utilitzar una bateria de bioassaigs, que utilitzin diferents models biològics com organismes prova. Així mateix, per tal d’extrapolar els efectes d’aquests agents tòxics en humans, és necessari utilitzar models biològics més propers a aquests.

Així doncs, aquest capítol s’ha dedicat a l’estudi de dos models biològics que seran utilitzats per avaluar la nocivitat de metalls i altres substàncies contaminants mitjançant l’anàlisi de biomarcadors moleculars de contaminació ambiental com les proteïnes d’estrès i les metal·lotioneïnes, les quals han estat descrites anteriorment en la introducció d’aquesta memòria.

Els diferents bioassaigs de toxicitat i els models biològics que aquests utilitzen han estat descrits i classificats en apartats anteriors, nogensmenys, abans de començar aquest estudi s’ha volgut establir una classificació d’aquests bioassaigs segons el tipus de material biològic que aquests

tilitzen.

I.1.1 Models biològics: classificació segons el tipus de material biològic

tilitzat

Els bioassaigs de toxicitat poden dividir-se en 3 categories d’experiments segons el tipus de material utilitzat. Una primera categoria és aquella que utilitza organismes enters. Una segona categoria és aquella que utilitza línies cel·lulars establertes permenentment in vitro. Finalment, una tercera categoria d’experiments és aquella que necessita de la preparació d’un cultiu primari de cèl·lules abans de cada experiment ja que aquestes només poden mantenir-se en cultiu durant un temps determinat. A continuació, es descriuen les característiques de cada una d’elles, així com els seus avantatges i inconvenients (Iwama et al., 1998).

III.1.1.1 Organismes enters

Els organismes enters poden utilitzar-se com a models biològics per a l’estudi de la contaminació ambiental. En aquests organismes enters es mesuren paràmetres de creixement o la mortalitat i també paràmetres a nivell molecular com les proteïnes d’estrès en teixits determinats. Un dels avantatges més importants d’utilitzar organismes enters és que els resultats obtinguts donen una informació molt acurada de la toxicitat real de la substància en qüestió sobre el medi ambient i sobre els organismes que hi viuen, evitant els problemes d’extrapolació dels resultats. Nogensmenys, també existeixen inconvenients importants com la interferència de molts factors sobre els resultats obtinguts. L’estrès o les variacions ambientals u

II

u

Capítol 3

152

causades per diferents paràmetres és superior a les dels cultius cel·lulars. A més a més, en la ajoria dels casos és necessària la mort de l’organisme amb els problemes ètics que això comporta (Segner, 1998; Carvalho et al., 2004). Així, per tal de mesurar l’efecte de diversos gressors ambientals poden utilitzar-se organismes molt diversos des de microorganismes

Vibrio fischeri), crustacis (Daphnia magna) i invertebrats (Lumbricus terrestris) fins a rtebrats inferiors (Sparus sarba). Una vegada els organismes enters han estat exposats a l’agressió ambiental corresponent, poden utilitzar-se diferents teixits de l’organisme per tal

’avaluar diferents paràmetres.

I.1.1.2 Línies cel·lulars establertes

s línies cel·lulars establertes poden definir-se com a tipus cel·lular diferenciat que pot antenir-se en cultiu indefinidament. La utilització de línies cel·lulars establertes té diversos vantatges; es tracta de cèl·lules fàcils de mantenir, uniformes, fàcils d’aconseguir en bundància i que han estat descrites anteriorment com a bons models experimentals per valuar l’efecte de diferents agressions ambientals. Així, aquestes línies cel·lulars han estat tals per a l’estudi bàsic dels processos cel·lulars de plegament de proteïnes i les interaccions ue es produeixen, entre d’altres fenòmens. D’altra banda, la utilització d’aquestes línies

l·lulars també presenta diversos desavantatges. Per començar, els efectes obtinguts després e l’exposició de les línies cel·lulars establertes a determinades agressions no es poden extrapolar sempre a l’efecte que aquestes mateixes causarien sobre organismes enters. Les

ies cel·lulars establertes són cèl·lules no diferenciades o canceroses que en molts casos no presenten l’estat metabòlic d’aquestes mateixes cèl·lules in vivo. Així mateix, l’estrès és un nomen que es detecta a nivell de comportament o a nivell fisiològic en els organismes enters, no en una determinada part o teixit cel·lular. La informació aconseguida a partir de les línies el·lulars pot no donar una visió global del que passa en l’organisme enter. Nogensmenys, valuació dels efectes de determinades agressions sobre aquestes línies cel·lulars són útils per conseguir una perspectiva general de la resposta cel·lular generada i de la toxicitat de l’agressor en concret. Un gran nombre de línies cel·lulars establertes han estat utilitzades

e proteïnes d’estrès (Delmas et al., 1995, 2000; Gaubin et al., 2000). La línia cel·lular RTG-2 procedent de Rainbow trout (Mosser et al., 1986; othary i Candido, 1981), la CHSE-214 procedent de Chinook salmon (Heikkila et al., 1982), ntre d’altres també es varen utilitzar per avaluar la nocivitat de diferents agents agressors

anàlisi de diferents proteïnes d’estrès. m a ( ve d

II

anteriorment per tal de caracteritzar l’efecte sobre el creixement, la inducció de proteïnes d’estrès o altres paràmetres. Línies cel·lulars humanes com la HT29, HepG2 o A549 han estat utilitzades per estudiar l’efecte de diferents d’agressions ambientals mitjançant l’anàlisi de la taxa de creixement i la inducció de l’expressió d

K e

Introducció general 153

III.1.1.3 Cultius de cèl·lules primàries

es cèl·lules primàries són aquelles cèl·lules obtingudes d’organismes enters que només poden tenir-se en cultiu durant un temps determinat. El principal avantatge de les cèl·lules

a diferència de les cèl·lules establertes, és que aquestes cèl·lules conserven el seu erenciat i per tant, les característiques corresponents. D’aquesta manera, representen estat metabòlic de la cèl·lula en qüestió i per tant, la resposta avaluada després de exposició de l’agressor és més fiable. Nogensmenys, per alguns tipus cel·lulars (cèl·lules lules renals, etc) és necessari matar l’organisme cada vegada que es vol alitzar un experiment per tal d’aconseguir les cèl·lules desitjades, la qual cosa suposa un esavantatge important dels cultius primaris.

n utilitzat aquest tipus de cèl·lules per estudiar agressions d’origen tural com el xoc tèrmic o l’efecte tòxic de substàncies contaminants. Brown et al (1992) aren estudiar l’efecte del xoc tèrmic en cultius primaris de cèl·lules renals de Pleuronectes americanus i altres autors com Koban et al (1987) varen estudiar l’efecte d’aclimatiació de

lules d’hepatòcits de Ictalurus punctatus. Així mateix, substàncies ontaminants també poden induir HSP70 i MTs en cultius de cèl·lules primàries hepàtiques i

nals (Currie i Tufts, 1997; Vijayan et al., 1998).

I.1.2 Descripció teòrica de les tècniques utilitzades.

apítol, la sobreexpressió de diverses proteïnes d’estrès i metal·lotioneïnes ha estat avaluada sobre dos models biològics diferents, cultius establerts de la línia cel·lular HT29 i cultius primaris de cèl·lules sanguínes de Sparus sarba, desprès de l’exposició d’aquests a metalls pesants. Atès que aquests experiments han estat efectuats en laboratoris diferents, el protocol experimental de l’anàlisi de les proteïnes d’estrès ha variat considerablement. Tot i això, la metodologia utilitzada és la mateixa, la qual es descriu a grans trets a continuació. Es tracta només d’una visió global dels mètodes utilitzats, ja que el protocol i el material específic utilitzat en cada cas s’especifica en els apartats corresponents.

III.1.2.1 Quantificació de proteïna total: Mètode Bradford.

El contingut de proteïna total d’una mostra abans i després dels diferents tractaments és de gran importància, ja que la sobreexpressió de proteïnes d’estrès (MT i HSPs) s’expressa relativa a una quantitat de proteïna total constant. El contingut de proteïna total de cada una de les mostres obtingudes després dels tractaments aplicats ha estat determinat mitjançant el mètode Bradford. Aquest mètode es basa en el canvi d’absorció que experimenta el colorant Comassie Brilliant blue en resposta a les diferents concentracions de proteïna (Bradford, 1976). Les mostres es dilueixen amb la solució Bradford i una vegada s’ha produït la reacció es llegeix L man primàries, estat dif millor l’ l’ hepàtiques, cèl· re d Diversos investigadors ha na v temperatura en cèl· c re

II

Capítol 3

154

l’absorbància a 595 nm. La quantifica concentracions creixents de la proteïna e

ció es basa en una recta patró realitzada a partir de stàndard albúmina bovina.

èn de la mida dels porus d’aquest (la qual depèn de la seva