4.1 Estilos educativos
CAPÍTULO 5.- Investigación Antecedentes y primera evaluación del programa.
Andrea HRICOVÁ, Eduard GOFFA, Roman HOLIČ, Michal ZÁHORSKÝ
Abstrakt: Analyzovali sme profil a obsah esenciálnych mastných kyselín a obsah skvalénu v semenách mutantných línií,
ktoré vznikli radiačnou mutagenézou druhu Amaranthus cruentus L. (15/1, 26/2, 26/3, 27/5, 82/1, 236/1) a hybridného druhu K-433 (A. hypochondriacus x A. hybridus L.; 54/1, 279/1, 282/1). Profily mutantov získané pomocou plynovej a kvapalinovej chromatografie sme porovnali s profilmi kontrolných, neožiarených foriem semien. Mutantné línie odvodené ožiarením hybridného genotypu K-433 vykazovali vyšší obsah esenciálnych mastných kyselín v porovnaní s inými autormi, pričom hybridná mutantná línia 54/1 vykazovala najvyšší podiel esenciálnych mastných kyselín (50,2 %). Obsah skvalénu sa pohyboval od 7,4 do 11,4 % z celkového oleja, čo je v porovnaní s doteraz uvádzanými literárnymi údajmi oveľa vyšší podiel tejto vzácnej a na ľudské zdravie pozitívne vplývajúcej substancie.
Kľúčové slová:, mastné kyseliny, skvalén, zrnový typ amarantu, mutagenéza, GC, HPLC
Abstract: We have analyzed profile and content of essential fatty acids and squalene content in seeds of mutant lines
generated by radiation mutagenesis of Amaranthus cruentus L. (15/1, 26/2, 26/3, 27/5, 82/1, 236/1) and hybrid K-433 (A. hypochondriacus x A. hybridus L.; 54/1, 279/1, 282/1). Profiles obtained by GC and HPLC were compared to profiles of control, non-iradiated seeds. The mutant lines originated from hybrid K-433, showed highest level of essential fatty acids compared to those found in the literature. Hybrid mutant line 54/1 appeared to have a highest content of screened essential fatty acids (50.2%). Squalene content varied from 7.4 to 11.4% of the total oil. These data of valuable and health promoting substance – squalene are much higher compared to data reported by other authors.
Key words: fatty acids, squalen, grain amaranth, mutagenesis, GC, HPLC, ÚVOD
Semená amarantu (Amaranthus spp.) majú atraktívne chemické zloženie a vysoký nutričný potenciál. Vyznačujú sa vysokým obsahom plnohodnotných bielkovín s dobre vyváženým zložením aminokyselín, najmä vysokým obsahom sírnych aminokyselín lyzínu a metionínu. Nutričná hodnota rastlinných bielkovín sa vo všeobecnosti porovnáva s výživovou hodnotou mliečneho kazeínu, ktorého bielkovinové zloženie sa považuje za ideálne. Práve vďaka vysokému obsah lyzínu, ako jednej z esenciálnych aminokyselín, ktorá sa vo väčšine zelených rastlín vôbec nevyskytuje, a iným aminokyselinám, ktoré sú v zrne amarantu obsiahnuté (Bartošová a Szabó, 2012), sa jeho výživová hodnota bielkovín takmer približuje kazeínu. Môže byť preto náhradou živočíšnych bielkovín v strave vegetariánov a vegánov. Nízky obsah lepkotvorných bielkovín prolamínov a glutelínov, predurčuje amarant na využitie v strave celiatikov, vyžadujúcich bezlepkovú diétu. Okrem toho obsahujú semená tejto prirodzenej bezlepkovej pseudoobilniny aj iné cenné zložky ako vitamíny, minerály, ktoré sa v iných druhov vyskytujú v menších príp. obmedzených množstvách.
Olej z amarantových semien má taktiež cenné zloženie. Tvoria ho predovšetkým nenasýtené mastné kyseliny. Najvyššie zastúpenie má kyselina linolová (C18:2; 44,6%), kyselina palmitová (C16:0; 22,2%) a kyselina olejová (C18:1; 29,1%; He a Corke, 2003) Pomer kyselín linolovej/α- linolénovej kyseliny (LA:ALA alebo ω-6/ω-3), je dôležitým faktorom pri znižovaní rizika srdcovo-cievnych ochorení (Simopoulos, 2008), ale ich pomer je vo výžive ľudí stále oveľa vyšší ako je odporúčané (od 6:1 do 3:1). Tang et al. (2014) uvádza ω-6/ω-3 pomer v listoch amarantu a quinoa ako veľmi priaznivý (3,89 – 2,28).
Semená amarantu sú taktiež prírodným zdrojom skvalénu, ktorý je prekurzorom dôležitých antioxidačných látok ako je napr. koenzým Q10. Má dokázateľné protirakovinové a cholesterol znižujúcimi účinky (Rao a Newmark., 1998; Miettinen a Vanhanen, 1994). Väčšina rastlinných olejov obsahuje veľmi malé množstvo skvalénu (napr. olivový olej 0,41 – 0,54 %), amarantový olej ho môže obsahovať až do 8% (Sun et al., 1997; Bruni et al., 2001). Tento cenný nutričný profil amarantových semien predurčuje jeho využitie ako alternatívu k bežným obilninám.
Cieľom práce bolo určiť obsah a kompozíciu mastných kyselín a obsah skvalénu v semenách mutantných línií amarantu, získaných v predošlom výskume radiačnou mutagenézou a vyselektovať potenciálny šľachtiteľský materiál s pridanou nutričnou hodnotou.
MATERIÁL A METÓDY
Na analýzu boli použité semená mutantných línií, ktoré vznikli radiačnou mutagenézou druhu
Amaranthus cruentus L. (15/1, 26/2, 26/3, 27/5, 82/1, 236/1) a hybridného druhu K-433
(A. hypochondriacus x A. hybridus L.; 54/1, 279/1, 282/1) ako aj kontrolné, neožiarené formy (A- kontrola/A. cruentus L. a B-kontrola/ A. hypochondriacus x A. hybridus L.). Rastlinný materiál bol pestovaný v Nitre, semená zozbierané v roku 2012.
Extrakciu mastných kyselín sme uskutočnili z 50 mg semien, ktoré sme vysušili v sušičke pri 105°C (4 hod.). K vysušeným semenám sme pridali 0,5 ml (C:17) rozpustenej v dichlórmetáne (interný štandard) a 1,2 ml metanolickej HCl. Vzorky sme následne inkubovali 6 hod. pri 60°C vo vodnom kúpeli. Po metylácii sme mastné kyseliny extrahovali pridaním 1,2 ml hexánu a 2 ml saturovaného roztoku NaCl (40g/100 ml). Vzorky sme 20 min. intenzívne miešali a následne centrifugovali. Hornú organickú fázu obsahujúcu metylestery mastných kyselín sme odobrali a preniesli do vialky. Vzorky sme odparili a rozpustili v 0,6 ml hexáne. Zloženie mastných kyselín bolo analyzované plynovou chromatografiou.
Skvalén sme extrahovali homogenizáciou 50 mg semien. Po homogenizácii sme pridali 3 ml zmesi KOH/metanol (60% KOH v 50% metanole) a inkubovali 2 hod. pri 70°C vo vodnom kúpeli. Po ochladení sme k vzorkám pridali 3 ml hexánu, premiešali a centrifugovali do oddelenia fáz. Vrchnú organickú fázu sme preniesli do čistej skúmavky a vzorky znova reextrahovali použitím 2ml hexánu. Vzorku sme zakoncentrovali odparením, rozpustili v 0,6 ml hexáne a obsah skvalénu sme analyzovali prostredníctvom HPLC.
VÝSLEDKY A DISKUSIA
Celkový obsah oleja v skúmaných líniách sa pohyboval v rozmedzí od 1,8 do 3,8 % (údaje nezobrazené). Celkové množstvo esenciálnych mastných kyselín (EMK) sa pohybovalo od 41,4 % do 50,2 % (obr. 1). Semená hybridných mutantných línií 54/1, 279/1 a 282/1 mali spomedzi analyzovaných vzoriek najvyššie zastúpenie esenciálnych mastných (50,2 %, 47,6 % a 46,9 %). U mutantných línií odvodených radiáciou druhu A. cruentus L. sme zaznamenali obsah EMK v rozmedzí od 41,4 % do 44,3 %. Zastúpenie EMK v semenách kontrolných vzoriek bolo 42,9 % (A- kontrola/A. cruentus L.) a 43,4 % (B-kontrola/ A. hypochondriacus x A. hybridus L.).
Najviac zastúpenými nenasýtenými mastnými kyselinami boli kyselina linolová (od 40,4 % do 48,9 %) a kyselina olejová (od 21,9 % do 30,7 %). Najvyšší obsah kyseliny linolovej sme určili v semenách hybridných mutantných línií 54/1 (48,9 %), 279/1 (46,4 %) a 282/1 45,7 %). Naopak, mutantné línie odvodené z A. cruentus L. vykazovali najvyšší podiel kyseliny olejovej - 15/1 (30,7 %), 26/2 (30,7 %), 26/3 (29,9 %), 27/5 (28,8 % ), 82/1 (30,7 % ) a 236/1 (30,6 % ). Kontrolné vzorky obsahovali v semenách 29,3% (A-kontrola/A. cruentus L.) 29,1 % (B-kontrola/A.
hypochondriacus x A. hybridus L.) kyseliny olejovej, podiel kyseliny linolovej bol v semenách
kontrolnej formy A 41,9 % a 42,3 % v semenách kontrolnej formy B.
Ostatné MK boli zastúpené v analyzovaných amarantových semenách menšom množstve, na úrovni nižšej ako 1 % z celkového percenta oleja.
Profil lipidov a nami zistené hodnoty v semenách mutantných línií amarantu zodpovedajú publikovaným údajom iných autorov (Hlinková et al., 2013; Gamel et al., 2007; Dhellot et al., 2006). Avšak, semená línií odvodené radiáciou hybridného druhu A. hypochondriacus x A. hybridus L. vykazovali po mutagenéze značne vyšší obsah esenciálnych MK ako uvádzajú doteraz publikované údaje.
Podobná distribúcia MK bola zaznamenaná pre slnečnicu a sóju (kyselina linolová 64 a 55 %, kyselina olejová 24 a 20 %). Gamel et al. (2007) uvádza že olej získaný z amarantových semien sa vyznačuje dobrou oxidačnou stabilitou, ktorá je vyššia ako u oleja zo semien slnečnice.
40,0 42,0 44,0 46,0 48,0 50,0 52,0 A- ko n tro la 15 /1 26 /2 26 /3 27 /5 82 /1 23 6/1 B- ko n tro la 54 /1 27 9/1 28 2/1
Suma esenciálnych MK
0 2 4 6 8 10 12 14 A- ko n tro la 15 /1 26 /2 26 /3 27 /5 82 /1 23 6/1 B- ko n tro la 54 /1 27 9/1 28 2/1Obsah skvalénu (%)
Obsah skvalénu sa v našich vzorkách pohyboval v rozmedzí od 7,4 % do 11,4 %. Jeho najvyšší podiel sme zistili u línie 26/2 (11,44 %) a 236/1 (11,34 %). Jeho obsah bol vysoký aj u kontrolnej línie A (11,1 %). V priemere mali línie odvodené radiáciou druhu A. cruentus L. vyšší podiel skvalénu ako línie získané aplikáciou radiačnej mutagenézy hybridného druhu K-433. Doposiaľ publikované literárne zdroje uvádzajú obsah skvalénu v semenách amarantu do 4, ojedinele do 6 %. V iných rastlinných olejoch sa jeho množstvo uvádza len do 0,5% z celkového percenta oleja.
Na základe uvedeného môžeme konštatovať, že obsah skvalénu v našich vzorkách je niekoľkonásobne vyšší ako uvádzajú doteraz publikované práce. Jeho obsah bol však vyšší aj u kontrolných vzoriek, čo naznačuje, že obsah skvalénu nebol zvýšený vplyvom γ žiarenia ale pravdepodobne vplyvom klimatických podmienok v danom pestovateľskom roku. Pre ďalšie závery o vplyve mutagenézy na obsah skvalénu bude potrebné analyzovať niekoľko ďalších generácií a vylúčiť vplyv interakcie environment x genotyp.
Obrázok 1 Analýza obsahu esenciálnych mastných kyselín a skvalénu v mutantných líniách amarantu. Obsah esenciálnych mastných kyselín a obsah skvalénu v semenách mutantov druhu A. cruentus L. (15/1, 26/2, 26/3, 27/5, 82/1, 236/1) a hybridného druhu A. hypochondriacus x A. hybridus L. (54/1, 279/1, 282/1), získaných po aplikácii γ žiarenia, a semenách kontrolných, neožiarených foriem (A- kontrola/A. cruentus L. a B-kontrola/ A. hypochondriacus x A. hybridus L.).
ZÁVER
Štúdia esenciálnych MK v semenách amarantových semien ukázala, že profil a podiel MK v mutantných líniách je porovnateľný s údajmi iných autorov. Avšak, semená línií odvodené radiáciou hybridného druhu K-433 (A. hypochondriacus x A. hybridus L.) vykazovali po mutagenéze značne vyšší obsah esenciálnych MK ako uvádzajú doteraz publikované údaje. Línia 54/1 vykazovala najvyšší obsah esenciálnych MK (50,2%).
Literárne zdroje uvádzajú obsah skvalénu v semenách amarantu do 4, ojedinele do 6%. V iných rastlinných olejoch sa jeho množstvo uvádza len do 0,5 % z celkového percenta oleja. Obsah skvalénu sa v našich vzorkách pohyboval od 7,4 do 11,4 %. z celkového percenta oleja. Na základe uvedených výsledkov môžeme povedať, že klimatické podmienky boli v Nitre v pestovateľskom roku 2012 veľmi vhodné pre akumuláciu skvalénu v semenách amarantu. Pre ďalšie závery o vplyve mutagenézy na akumuláciu skvalénu bude potrebné analyzovať niekoľko ďalších generácií a vylúčiť tak vplyv interakcie environment x genotyp.
LITERATÚRA
BARTOŠOVÁ ,M.L. − SZABÓ, J.K. 2012. Technological properties of spelt - amatanth composite flours. In Research Journal of Agricultural Science, 2012, vol. 1, p. 90-93.
BRUNI, R. − MEDICI, A. − GUERRINI, A. et al. 2001. Wild Amaranthus caudatus seed oil, a nutraceutical resource from Ecuadorian flora. In J. Agric. Food Chem., 2001, vol. 49, p. 5455-5460.
DHELLOT, J.R. − MATOUBA, E. − MALOUMBI, M.G. et al. 2006. Extraction, chcemical composition and autrional characterization of vegetable oils: Case of Amaranthus hybridus (var 1 and 2) of Congo Brazzaville. In Afr. J. Biotechnol., 2006, vol. 5, pp. 1095-1101.
GAMEL, T.H. − MESALLAM, A.S. − DAMIR, A.A. et al. 2007. Characterization of amaranth seed oils. In J. Food Lipids, 2007, vol. 14, p. 3223-334.
HE, H. − CORKE, H. 2003. Oil and squalene in Amaranthus grain and leaf. In J. Agric. Food Chem., 2003, vol. 51, p. 7913-7920.
HLINKOVÁ, A. − BEDNÁROVÁ, A. − HAVRLENTOVÁ, M. 2013. Evalution of fatty acid composition among selected amaranth grains grown in two consecutive years. In Biologia, 2013, vol. 4, p. 641-650.
MIETTINEN, T. A. − VANHANEN, H. 1994. Serum concentration and metabolism of cholesterol during rapeseed oil and squalene feeding. In Am. J. Clin. Nutr., 1994, vol. 59, p. 356.
RAO, C. V. − NEWMARK, H. L. 1998. Chemopreventive effect of squalene on colon cancer. In Carcinogenesis, 1998, vol. 19, p. 287.
SIMOPOULOS, A.P. 2008. The importance of the omega-6/omega-3 fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronic diseases. In Exp. Biol. Med., 2008, vol. 233, p. 674–688. SUN, H. − WIESENBORN, D. − TOSTENSON, K. et al. 1997. Fractionation of squalene from amaranth seed oil.In J. Am. Oil Chem. Soc., 1997, vol. 74, p. 413.
TANG, Y. – LI, X. – CHEN, P. X. et al. 2014. Lipids, tocopherols, and carotenoids in leaves of amaranth and quinoa cultivars and a new approach to overall evaluation of nutritional quality traits. In J. Agric. Food Chem., 2014, vol. 62 p. 12610-12619.
Poďakovanie:
Práca bola podporená Slovenskou vedeckou grantovou agentúrou VEGA, projekt č. 2/0066/13: Využitie moderných biotechnológií v šľachtiteľskom programe láskavca, Slovenskou Agentúrou na podporu výskum a vývoja, projekt č. APVV-0785-11: Lipotoxicita v kvasinkách: mechanizmy ochrany proti nahromadeným mastným kyselinám a skvalénu a projektu Európskeho spoločenstva no.26220220180: Vybudovanie výskumného centra "Agrobiotech".
Kontaktná adresa:
1. Andrea Hricová, Oddelenie populačnej genetiky a šľachtenia, Ústav genetiky a biotechnológií rastlín SAV, Akademická 2, Nitra, 950 07, [email protected],
2. Goffa Eduard, Oddelenie biochémie a biomembrán, Ústav živočíšnej biochémie a genetiky SAV, Moyzesova 61, Ivánka pri Dunaji, 900 28, [email protected],
3. Holič Roman, Oddelenie biochémie a biomembrán, Ústav živočíšnej biochémie a genetiky SAV, Moyzesova 61, Ivánka pri Dunaji,900 28, [email protected],
4. Michal Záhorský, Oddelenie populačnej genetiky a šľachtenia, Ústav genetiky a biotechnológií rastlín SAV, Akademická 2, Nitra, 950 07, [email protected]
SPEKTRUM MASTNÝCH KYSELÍN INTRAMUSKULÁRNEHO TUKU JAHNIAT