Columnes reblertes, empacades o particulades. En HPLC s'utilitzen dos tipus de columnes, les reblertes o particulades i les monolítiques. Amb finalitat analítica s'utilitzen columnes de diversos diàmetres i longituds (Fig. 13, esquerra). També es construeixen columnes de gran diàmetre, per a ser utilitzades a escala preparativa (Fig. 13,
dreta). Les columnes es construeixen en acer i en plàstic PEEK, excepte les capil·lars, que són de sílice flexible amb recobriment extern de poli-imina (com les capil·lars de GC, encara que molt més curtes).
Fig. 12. Mòduls de bombes binari o de mescla a alta pressió (esquerra) i quaternari o de mescla a baixa pressió (dreta)
Mesclador B Eixida A Fase A Fase B Eixida Fase A Fase B Fase C Fase D
Fig. 12. Mòduls de bombes binari o de mescla a alta pressió (esquerra) i quaternari o de mescla a baixa pressió (dreta)
Mesclador B Eixida A Fase A Fase B Mesclador B Eixida A Fase A Fase B Eixida Fase A Fase B Fase C Fase D Eixida Fase A Fase B Fase C Fase D
Fig. 13. Columnes d’HPLC a escala analítica (esquerra) i preparativa (dreta)
Fig. 13. Columnes d’HPLC a escala analítica (esquerra) i preparativa (dreta)
Mida de partícula i eficàcia. Els rebliments estan constituïts per partícules de sílice que suporten una fase estacionària enllaçada. Les columnes reblertes clàssiques contenen partícules de sílice entre 5 i 2.6 μm de diàmetre. Com s'il·lustra en la Fig. 14, i a causa de la reducció dels termes A i C de l'equació de Van Deemter, s'aconsegueixen augments molt importants d'eficàcia reduint el diàmetre de les partícules. A principis de l'actual segle XXI, s’han introduït en el mercat columnes amb partícules de diàmetres inferiors a 2 μm denominades “sub 2” (per exemple, 1.6 μm).
Per a una columna reblerta, i a un valor donat de la velocitat lineal amitjana,, l'eficàcia és inversament proporcional al diàmetre de partícula, dp:
N ~ K L / dp (1)
on K és un coeficient que depèn de la qualitat del rebliment, i L és la longitud de la columna. La millora de l'eficàcia en reduir la mida de partícula es deu, d'una banda, al fet que el flux és més uniforme, la qual cosa redueix el coeficient A de l'equació de Van Deemter. D'altra banda, la difusió del solut en la fase mòbil (en els intersticis entre les partícules, i en l'interior dels porus de les partícules) es fa a través de distàncies més curtes, la qual cosa també redueix el terme C.
Un altre avanç en tecnologia de columnes, introduït a principis de l'actual segle, han sigut els rebliments de partícules del tipus “nucli sòlid” (fused-core) o “corfa-nucli” (shell-core). Aquests rebliments reben diversos noms segons el fabricant. Els rebliments corfa-nucli permeten aconseguir eficàcies dues o tres vegades majors que les aconseguides amb rebliments convencionals: en l'equació (1), el coeficient K és unes 2-3 vegades més gran. Aquests rebliments estan constituïts per partícules amb una regió central no porosa, de manera que els porus són poc profunds (Fig. 15). Per això, la fase mòbil té accés tan sols a la capa externa de les partícules. Això redueix molt el terme C de l'equació de Van Deemter (Fig. 14), perquè els soluts entren i surten amb rapidesa. La partícula de la Fig. 15 té un
diàmetre de 2.6 μm, però només la capa exterior, de 0.5 μm de gruix, és porosa.
Mida de partícula, cabal i contrapressió. El preu que es paga per utilitzar partícules molt fines és la resistència al flux. Exemple: un cabal típic d'1 mL min-1 en una columna de 4.6 mm de diàmetre i 10 cm de longitud, amb partícules de 5 μm, i fase mòbil aquosa podria donar una contrapressió d'uns 10 MPa. La contrapressió és molt major si es redueix el diàmetre de les partícules, i també augmenta si la columna està deteriorada o envellida, o si s'utilitza una fase mòbil més viscosa (com per exemple, mescles metanol-aigua prop del punt de màxima viscositat, 40% de metanol), o temperatures baixes.
Eficàcia i qualitat del rebliment. Els rebliments de qualitat estan constituïts per partícules esfèriques (microfotografia adjunta), d'un estret interval de mides, i empaquetades de la manera més densa i regular possible. La regularitat de l'empaquetatge és important per a reduir el volum mort, i per a aconseguir una màxima eficàcia i un llit estable amb el temps.
Velocitat lineal de la fase mòbil H 2 μm 20 μm 5 μm 3 μm 3 μm corfa-nucli
Fig. 14. Gràfics de van Deemter per columnes amb reblerts de partícules de diversos tipus
Velocitat lineal de la fase mòbil H 2 μm 20 μm 5 μm 3 μm 3 μm corfa-nucli Velocitat lineal de la fase mòbil H 2 μm 20 μm 5 μm 3 μm 3 μm corfa-nucli
Fig. 14. Gràfics de van Deemter per columnes amb reblerts de partícules de diversos tipus
Fig. 15. Microfotografia d’una partícula corfa- nucli: només la capa externa és porosa Fig. 15. Microfotografia d’una partícula corfa- nucli: només la capa externa és porosa
Eficàcia i qualitat del rebliment. Els reblerts de qualitat estan constituïts per partícules esfèriques (microfotografia de la Fig. 16, esquerra), d'un estret interval de mides, empaquetades de la manera més densa i regular possible. La regularitat del rebliment és important per reduir el volum mort, i per aconseguir una màxima eficàcia i un llit estable amb el temps. Els rebliments de poca qualitat experimenten un envelliment més ràpid. Un rebliment “envelleix” quan les partícules es mouen, deixant zones amb buits excessivament grans i altres amb un empaquetatge més dens, la qual cosa es tradueix en pèrdua d'eficàcia i en un augment de la pressió necessària per a mantenir el cabal.
Les columnes monolítiques. En el context de la cromatografia líquida, un monòlit és una fase estacionària contínua (no conté partícules), constituïda per una peça única d'un material rígid proveït d'una microestructura porosa molt homogènia (Fig. 16, dreta). El material pot ser sílice (com en la microfotografia) o un polímer orgànic. La microestructura porosa s'aconsegueix per mitjà de
tècniques especials de precipitació de la sílice, o si és el cas, de polimerització. A continuació es pot 'funcionalitzar' la superfície dels porus, açò és, enllaçar una fase estacionària del mateix tipus de les utilitzades en columnes reblertes. S'aconsegueixen així fases estacionàries amb diferents propietats: hidrofòbiques, polars, polaritzables o de bescanvi iònic. En particular, els monòlits de sílice són altament reproduïbles, la seua eficàcia és molt alta, i donen lloc a excel·lents separacions.