2. La injecció manual i automàtica.
3. Bombes per a elució isocràtica i en gradient. 4. Les columnes: tipus i criteris de selecció. 5. La força eluent i el seu control.
6. La selectivitat global de les fases mòbils. El triangle de selectivitat de Snyder. 7. Optimització de la composició de la fase mòbil en mode isocràtic.
8. Optimització de la composició de la fase mòbil en mode gradient. 9. Influència de la temperatura de la columna.
10. Detectors en cromatografia líquida: classificació. 11. La detecció espectrofotomètrica.
12. Problemes.
1. Modes d’HPLC. El cromatògraf d’HPLC
Modes d’HPLC. En cromatografia de líquids d'alta resolució o HPLC (high performance liquid chromatography), la fase mòbil és un líquid. Per la seua banda, la fase estacionària pot ser:
a) La superfície d'un sòlid en cromatografia d'adsorció, si bé la retenció per adsorció s'utilitza sobretot en columnes de resolució baixa i mitjana, sent rar utilitzar-la en HPLC.
b) Una fase enllaçada en cromatografia de repartiment. Depenent de la polaritat de la fase estacionària es distingeixen tres modalitats:
- Fase inversa, invertida o reversa (RP-HPLC, reverse-phase), quan la fase estacionària és hidrofòbica i la fase mòbil polar (aquosa o hidroorgànica).
- Fase normal (NP-HPLC, normal-phase) quan la fase estacionària és polar i la fase mòbil és hidrofòbica (un hidrocarbur, i dissolvents miscibles amb ell).
- Interacció hidrofòbica (HILIC, hydrophobic interaction liquid chromatography), quan la fase estacionària té una superfície polar, com en fase normal, recoberta d'una capa d'aigua adsorbida. La fase mòbil és una mescla hidroorgànica (quasi sempre aigua i acetonitril, veure tema II.1).
c) Un bescanviador iònic en cromatografia de bescanvi iònic. Pot ser un bescanviador catiònic o aniònic. Aquesta modalitat d’HPLC es coneix com a cromatografia iònica (IC, ion chromatography).
d) Els porus d'un sòlid microporós o d'un gel, en cromatografia d'exclusió molecular (SEC, size exclusió chromatography). S'utilitza per a caracteritzar macromolècules (polímers).
Aquest tema està dedicat a l’HPLC de repartiment, i en el tema següent es tracta la cromatografia iònica. En comparació amb la GC, en HPLC la naturalesa dels soluts no està limitada per la seua volatilitat. A més, en GC la fase mòbil és un portador no actiu, mentre que en HPLC els components de la fase mòbil intervenen activament en les separacions. En HPLC, els soluts estableixen interaccions dels mateixos tipus amb les dues fases, mòbil i estacionària: atraccions dipol-dipol, donació i acceptació de protons, etc. D'aquesta manera, els factors que poden modificar-se per a aconseguir una separació són molt més nombrosos en HPLC que en GC, on només la fase estacionària és activa. Per això, l’HPLC comprèn un conjunt nombrós de tècniques d'alta eficàcia, aplicables a la separació d'una molt àmplia varietat de compostos de polaritat molt diversa, i d'un rang molt ampli de masses moleculars.
El cromatògraf d’HPLC. Els equips per a HPLC consten dels elements següents (Fig. 1):
1) Els flascons de reserva de dissolvents (entre 1 i 4) i un desgasificador en línia, per a eliminar els gasos de l'aire dissolts en les fases mòbils. No representat a la Fig. 1, el desgasificador se situaria entre les ampolles de dissolvent i el mòdul de bombes. És molt convenient que les fases mòbils estiguen desgasificades, ja que la solubilitat dels gasos de l'aire varia amb les proporcions dels distints dissolvents, i amb la pressió i la temperatura. En dissolucions no desgasificades, una reducció de la solubilitat dels gasos deguda a la pèrdua de pressió al llarg de la columna provoca l'aparició de bombolles, que donen lloc a falsos pics i a un augment del soroll de fons en els detectors. La desgasificació de les fases mòbils es sol realitzar amb desgasificadors en línia: la fase mòbil passa per un tub de plàstic permeable als gasos, però no als líquids, situat en l'interior d'una cambra a pressió reduïda. Els gasos dissolts es perden a través de la paret del tub.
2) El mòdul de bombes capaç de mantenir un cabal menut i constant, i d'aconseguir almenys 40 MPa (com que un mega Pascal són 10 atmosferes, unes 400 atm). Per mantenir un cabal adequat de fase mòbil a través de rebliments de partícules molt xicotetes (típicament de 2,6 a 5 µm en columnes d'uns 10 o 15 cm) es necessiten pressions en el rang de 10 a 20 MPa. La pressió de treball necessària per a mantenir el flux (açò és, per a igualar la contrapressió) augmenta ràpidament quan es redueix el diàmetre de les partícules del rebliment. Per la seua banda, les columnes monolítiques actuals tenen una xarxa contínua de porus amb diàmetres de l'ordre de 2 a 3 µm. La contrapressió necessària per a fer passar el cabal és menor en monòlits que en columnes reblertes a causa de la major proporció d'espai que ocupen els porus dels monòlits. La proporció d'espai buit o porositat és de l'ordre del 80% en columnes monolítiques, i d'un 40% en columnes reblertes.
3) El mòdul d'injecció manual o automàtic. En aquest últim cas, el sistema d'injecció tindrà també un suport pels vials de les mostres i un xicotet braç robotitzat per a realitzar les injeccions. Una part essencial del sistema d'injecció és una vàlvula de 6 vies (o 6 ports) i 2 posicions.
4) La columna, precedida d'una precolumna (guard column), més curta. A escala analítica, s'utilitzen columnes amb diàmetres interns que van des de menys de 0.1 mm (HPLC capil·lar) fins a 4.6 mm. Les columnes són curtes, amb longituds típiques de 10 o 15 cm que arriben com a màxim als 35 o 40 cm. Es construeixen en acer inoxidable (Fig. 2) o en PEEK (poly-ethylen-ether-ketone) (Fig. 3), un
Fig. 1. Esquema de cromatògraf d’HPLC, construït amb mòduls de diferents models comercials: 1, safata amb les ampolles de dissolvents; 2, mòdul de bombes; 3, injector automàtic; 4, compartiment de columnes amb termòstat; 5, detector; 6, ordinador
Dissolvents Bombes Injector Columna Detector
Fig. 1. Esquema de cromatògraf d’HPLC, construït amb mòduls de diferents models comercials: 1, safata amb les ampolles de dissolvents; 2, mòdul de bombes; 3, injector automàtic; 4, compartiment de columnes amb termòstat; 5, detector; 6, ordinador
Dissolvents Bombes Injector Columna Detector Dissolvents Bombes Injector Columna Detector
plàstic resistent als dissolvents i capaç de suportar elevades pressions sense deformar-se.
La separació té lloc en la columna. La funció de la precolumna és protegir la columna de la presència de compostos agressius que pogueren deteriorar la fase enllaçada, i evitar l'entrada de partícules en el rebliment. La precolumna ha de contenir el mateix rebliment que la columna, si bé la seua longitud és molt menor que la columna (com per exemple, 1 cm per a columnes de 10 o 15 cm), pel que contribueix poc a la contrapressió. La precolumna se substitueix després d'un temps prudencial d'ús. Freqüentment, les columnes es posen dins un compartiment termostatitzat. La temperatura de la columna es controla habitualment al voltant de 20 o 25 ºC. Temperatures entre 10 i 60 ºC són prou freqüents.
Tots els espais accessibles a la fase mòbil estan units per mitjà de tubs de 1/16 (1/16 de polzada anglesa de diàmetre extern) i peces d'unió. Tubs i unions es construeixen en acer inoxidable o en plàstic PEEK. Per a reduir al mínim la seua contribució al volum mort, es trien tubs amb diàmetres interns molt xicotets, de 5 i 7 mil·lèsimes de
polzada. Per la mateixa raó, les unions es dissenyen de manera que l'espai lliure siga el mínim possible (idealment, zero). Per això, aquestes peces d'unió es denominen ZDV (zero dead volum) (Fig. 3). Perquè la unió siga hermètica, la nou (la peça amb el mascle del caragol) pressiona la fèrula (un anell cònic) contra el seient de la unió ZDV, de manera que al seu torn la fèrula quede ajustada sobre el tub.
5) El detector (espectrofotomètric, fluorimètric, evaporatiu, electroanalític, MS, etc.) o dos detectors en sèrie (el primer no destructiu). En cromatografia preparativa, el detector, que ha de ser no destructiu, està seguit d'un col·lector de fraccions.
6) El sistema d'adquisició i tractament de dades. Els equips d’HPLC solen tenir un disseny modular, amb mòduls que es comuniquen entre ells per mitjà d'una connexió digital. En la Fig. 5 es mostra un equip d’HPLC amb els mòduls apilats per a estalviar espai sobre la taula del laboratori. A la dreta, de dalt a baix,
desgasificador i el mòdul de bombes. A l’esquerra, i de dalt a baix: l'injector automàtic, el compartiment termostatitzat de columnes (amb la tapa retirada) i dos detectors.