Linealidad y Rango de trabajo

La linealidad de un método analítico es la capacidad para poder producir resultados directamente proporcionales (o por medio de una transformación matemática) a la concentración de un analito en la muestra. La función de calibración en este estudio siempre se ajustó a una función lineal y, conforme a esto, se probaron los supuestos asociados a lugar teniendo de partida las siguientes consideraciones [200]:

 Por lo menos 6 niveles de calibración cuando fuera posible.

 Niveles igualmente espaciados o entre 50-150% del nivel crítico a evaluar (LMR).

 Triplicados independientes y aleatorios de estándares por cada nivel.

Estas consideraciones se tuvieron en cuenta para la construcción de las curvas de calibración. Sin embargo, respecto al primer punto, las curvas de calibración de un pequeño grupo de compuestos sólo tienen 5 niveles para ambas metodologías, debido a que el primer punto usado (0,010 µg.mL-1) en algunos casos no fue cuantificable (<LOQ) e hizo necesario establecer la menor concentración o Nivel Inferior de Calibración (NIC) en el siguiente nivel (N2-N6). En todas las curvas de calibración el NIC estipulado (en µg.mL-1_{) corresponde}

directamente al LOQ definido en la metodología (en mg.kg-1) pues el factor de conversión corresponde a la unidad. Así pues, se calculó la ecuación lineal por el método de los mínimos cuadrados para cada señal (normalizada con el E.I. (PCB 52)). Estos parámetros se encuentran especificados en el Anexo 25, en el que se expresa el intercepto y la pendiente con el número adecuado de cifras significativas especificando su desviación estándar particular (Sa y Sb).

La evaluación de la linealidad fue realizada con parámetros adicionales que validaron la inspección visual de la curva de calibración. Toda la evaluación estadística de la linealidad se realizó al 95% de confianza. Entre las herramientas empleadas se realizó un test de comparación de medias (t de Student) para las siguientes hipótesis:

 Ho1: El intercepto no es significativamente diferente de cero (a=0)

 Ho2: La pendiente no es significativamente diferente de cero (b=0)

 Ho3: No existe correlación entre la concentración y la respuesta (NEXY) Idealmente, si la primera prueba (Ho1) se supone no significativa se podría aceptar la hipótesis nula, y el método se consideraría específico en ausencia del analito pues no debería esperarse señal alguna. Sin embargo, como se ha visto, la selectividad limitada en la detección da lugar a eventuales interferencias. Por otro lado, para todas las señales se rechazó la hipótesis nula de la pendiente (Ho2) ya que la señal siempre cambió con la concentración, no permanecía constante. Adicionalmente, para todas las señales se rechazó la hipótesis Ho3 que indica que no hay regresión entre la concentración y la respuesta, pues se confirmó con valores del coeficiente de correlación r >0,99 con excepción de compuestos como diclofuanid, difenoconazol y azoxistrobin por el método ACEN, aunque como se sabe, el juicio de linealidad con este coeficiente tiene un valor limitado.

Respecto al ajuste al modelo lineal, se realizó un ANOVA en el que se descompuso la varianza del modelo entre la varianza debida a los factores de regresión y carencia de ajuste, para la cual se rechazó la hipótesis Ho4 en todos los casos, mientras que varios compuestos presentaron un desvío significativo de la linealidad al rechazar la Ho5.

 Ho4: No hay regresión significativa entre concentración y respuesta (NRXY)

Es importante notar que en caso de que no se cumplieran las hipótesis del modelo, estos resultados no indicarían irrevocablemente que no se cumplía el modelo lineal para esta aplicación. Estas desviaciones sólo quieren decir que la prueba es muy exigente y por ejemplo, habría un desvío de la linealidad a este nivel de confianza al rechazar a Ho5. Una opción trivial para resolver lo anterior sería disminuir el nivel de confianza, pero en realidad se puede demostrar que el modelo lineal si fue el adecuado por otros medios. Por ejemplo, el compuesto Azoxistrobin en el caso del método ACEN, presenta significancia para Ho5 indicando que aparentemente hay desvío de la linealidad (aún con r = 0,99035), sin embargo como se observa en la Tabla 23, el valor r2 _{es el mayor entre otras alternativas. Esto indica}

claramente que a pesar de la conclusión estadística, la escogencia de éste entre otros modelos, es la que mejor puede explicar la varianza asociada en la curva de calibración.

Tabla 24. Comparación de modelos alternativos para el azoxistrobin en el método UCEN.[217]

Otras maneras de juzgar la linealidad puede ser usando la gráfica de residuales. En la Figura 77 se puede observar que en la tabla de valores para el endosulfan α por el método ACEN, la gráfica y las conclusiones estadísticas presentan buenos resultados, y que además los residuos se encuentran distribuidos de manera uniforme y sin tendencias apreciables en todo el rango de concentración.

Figura 77 . Curva de calibración de endosulfan α en matriz de arroz.

Uso de AESA. Respuesta normalizada con E.I. Resultados de las 5 pruebas estadísticas S: Significativa, NS: No significativa.

Sin embargo, a pesar de que la Figura 78 también presenta una buena gráfica y conclusiones esperadas, en un caso similar para el HCB por el método UCEN se observa que el gráfico de residuales tiene un aumento incuestionable con la concentración. Esto reveló inmediatamente un patrón de heterocedasticidad típico de algunas curvas de calibración, que podría resolverse empleando una calibración ponderada. Sin embargo, en el análisis a nivel de residuos se emplean curvas de calibración convencionales ya que este comportamiento es relativamente normal y no incurre en errores exagerados.

Figura 78. Curva de calibración de HCB en matriz de uchuva.

Uso de AESA. Respuesta normalizada con E.I. Resultados de las 5 pruebas estadísticas S: Significativa,NS: No significativa.

Por último, otra manera mucho más útil que la inspección visual de la recta o el coeficiente de correlación, que en algunos casos pueden llegar a ser engañosos, es la evaluación de los resultados a través una gráfica donde se relaciona la concentración y la proporción entre la respuesta y la masa de analito inyectada. Esta relación es mucho más sensible a la falta de linealidad [218]. En las Figuras 77 y 78 es posible observar ligeras variaciones pero en realidad la tendencia se mantiene relativamente estable a través del rango de trabajo. No hay un criterio unificado respecto a la definición del concepto del rango de trabajo puesto que algunos autores indican que podría calcularse como la razón entre la concentración del nivel superior y el inferior (0,250µg.mL-1/0,010 µg.mL-1=25), pero en realidad algo más importante que su magnitud es su utilidad derivada de la linealidad. Según la ICH [211] éste se establece al confirmar que el método provee un grado aceptable en términos de linealidad, exactitud y precisión cuando se ejecuta en concentraciones a los extremos de la curva de calibración, o por ejemplo, en un caso análogo en farmacología para la determinación de impurezas con potencial efecto tóxico, desde el límite de cuantificación hasta el límite regulatorio. En este estudio ambos valores (LOQ y LMR) coinciden en la mayoría de plaguicidas y en los casos en donde no ocurre, los valores se encuentran con seguridad dentro del rango calibrado. En ese sentido, el desempeño del método en el rango de trabajo se puso a prueba en el apartado a continuación.