Lipasa B de Candida antarctica

Candida antarctica es una levadura basidiomiceto que presenta actividad lipásica aún a altas temperaturas. A partir de esta levadura se han aislado dos lipasas diferentes, denominadas A y B, con distintos puntos isoeléctricos (pI) y pesos moleculares. La lipasa A (CALA) no es específica y es la lipasa más estable. Tiene un peso molecular de 45 kDa y un pI de 7.5. La lipasa B (CALB) tiene un peso molecular de 33 kDa y un pI de 6.0. Esta enzima es muy específica tanto para la hidrólisis como para la síntesis orgánica lo que la hace aplicable a la síntesis enantioselectiva de compuestos ópticamente puros (Uppenberg et al, 1994). En la Figura 13 se presenta una estructura tridimensional de esta enzima.

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La enzima CALB está compuesta por 317 residuos aminoacídicos. La secuencia de aminoácidos (Figura 14) no presenta una homología importante a las secuencias de otras lipasas. Al igual que las estructuras determinadas para otras lipasas, CALB contiene la tríada catalítica Ser105-Asp187-His224. Sin embargo, la secuencia consenso encontrada en las lipasas cercanas a la Ser105 del sitio activo, Gly-X-Ser-X-Gly, no está presente en CALB. En su lugar, la primera glicina conservada ha sido reemplazada por una treonina, dando la secuencia Thr-Trp-Ser-Gln-Gly. Por otro lado, la secuencia de aminoácidos sugiere un sitio posible de N-glicosilación, con la secuencia característica Asn-Thr en Asn74. Esta aspargina, seguida por un residuo de ácido aspártico y de treonina, es la única en la cual la densidad electrónica indica una glicosilación (Uppenberg et al, 1994).

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Figura 14. Secuencia de ADN y aminoácidos (estructura primaria) de CALB. Los números hacen referencia a la posición de los aminoácidos. Los residuos del sitio activo están marcados con doble subrayado, y la N-glicosilación con líneas punteadas

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Es una proteína globular del tipo _{α/β. Las láminas β} centrales están compuestas por

7 cadenas de las cuales las últimas 6 son paralelas. El número de hélices α y hojas β

están graficados en la Figura 15. La mayoría de las uniones entre las estructuras están

formadas por el motivo estructural β-_α-_{β por derech}a. Hay dos excepciones que

involucran la conexión antiparalela entre las cadenas β1 y β2, y las últimas dos láminas β forman una estructura β-bucle-_{β por derecha. Además, en los últimos 12 residuos de}

la proteína se encuentra una región tipo lámina β que forman un par de cadenas

unidas por uniones de hidrógeno con una unión β tipo horquilla. En la estructura hay 10 hélices α. Las hélices α5, α6 y α10 constituyen la mayor parte del bolsillo del sitio

activo (Uppenberg et al, 1994).

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La serina de la tríada catalítica se encuentra entre el extremo carboxi-terminal de la lámina _β4 y la próxima hélice _α4. Debido a que la secuencia consenso alrededor de Ser105 no se encuentra en CALB, la orientación relativa de la lámina _β y la hélice _α en este sitio es diferente con respecto a otras lipasas, por lo tanto se podría decir que la sustitución de Gly por Thr causa el movimiento de la hélice _α.

La histidina del sitio activo, His224, se encuentra al principio de la hélice _α9, de forma que las cadenas laterales se orientan hacia el sitio activo. El ácido aspártico del sitio activo, Asp187, se ubica en un giro luego de la sexta lámina _{β. Los átomos de} oxígeno forman puentes de hidrógeno con las cadenas principal y lateral así como con moléculas de agua.

CALB posee un hueco oxianiónico que mediante puentes de hidrógeno estabiliza los estados de transición y el oxianión formado en la reacción. Este hueco es una disposición espacial de tres dadores de puentes de hidrógeno, dos del grupo amida de Thr40 y Gln106 y uno de la cadena lateral de Thr40.

Se ha intentado racionalizar la preferencia enantiomérica de las lipasas basándose

en los requerimientos estéricos de los sustituyentes según las denominadas “reglas de Kazlauskas”, las cuales se resumen en la Figura 16. La experiencia ha demostrado que la regla es bastante predictiva para la acción de las lipasas sobre alcoholes secundarios, pero menos para las transformaciones de alcoholes primarios y ácidos carboxílicos (José, 2013).

Figura 16. Reglas de Kazlauskas. M: sustituyente de tamaño medio, L: sustituyente de tamaño grande (extraída de José, 2013).

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La enantioselectividad de CALB hacia los alcoholes secundarios está determinada por requerimientos estéricos. En la estructura cristalina de la enzima se determinaron dos bolsillos que los sustratos pueden ocupar (Figura 17). El bolsillo de tamaño mediano no permite un grupo mayor al etilo, mientras que la restricción de tamaño en el bolsillo grande casi es ilimitada. Esto implicaría que para enantiómeros con un grupo mayor al etilo, solo uno de los dos enantiómeros podría encajar en el sitio activo, lo cual otorga la enantioselectividad característica de CALB (Uppenberg et al, 1994).

Figura 17. Esquema del sitio activo formado por los bolsillos mediano y grande.

CALB es una enzima excepcionalmente robusta que se desactiva a 50-60 °C (soporta temperaturas mayores cuando se encuentra inmovilizada). CALB es considerada una especie intermedia entre esterasa y lipasa típica, ya que no muestra un efecto pronunciado de activación interfacial. Por lo anterior, es posible que CALB no posea el polipéptido tapadera que regula el acceso al sitio activo, si no que su estructura es como si estuviese siempre en conformación abierta, con una entrada bastante

restringida al sitio activo. Una corta hélice α5 se identificó como potencial tapadera

debido a su posición y a cierta transición orden/desorden observada en esta zona al analizar mediante rayos X los cristales de CALB en diferentes entornos cristalinos (Uppenberg et al, 1994).

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