Lista de chequeo

Figura 2.2: Diagrama causa efecto:

El diagrama causa efecto es el resultado del diagnostico para conseguir la reconstrucción tridimensional de imagenes a diferentes niveles con los instrumentos existentes en el Centro de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana.

dencia que la solución de cada problema pueda tener sobre la solución total de la situación. Al aplicar este método al proyecto de investigación se obtuvie- ron resultados muy similares y complementarios a los obtenidos mediante el método de Pareto.

Cabe anotar que este trabajo de investigación tiene como fundamento un ti- po de investigación experimental centrada en conceptos básicos de la óptica, el desarrollo tecnológico y aportes pedagógicos visualizados en las diferentes eta- pas de investigación. Esto permite definirlo como un trabajo de investigación básico experimental (Zorrilla, 1993).

2.3. Lista de chequeo

Los resultados de la etapa de diagnóstico se resumen con la siguiente lista

de chequeo1_:

1. Identificar el tipo de equipo existente en el laboratorio y evaluar su posible aplicación en la reconstrucción tridimensional, 3D.

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA. 2.3. LISTA DE CHEQUEO

pueden tratar a lo largo del trabajo de investigación.

3. Identificar el tipo de cámara fotográfica de mayor resolución y que mejor se adecuara al presupuesto para la captura de imágenes.

4. Evaluar la posibilidad de adecuar la cámara obtenida en los microscopios de MET y de Campo Claro o de luz.

5. Buscar generar alternativas que permitan la eliminación de interferencias ópticas debidas a elementos diferentes al espécimen.

6. Realizar pruebas de captura de imágenes con microscopio confocal bus- cando mejorar la resolución y fidelidad de la imágen para validar el méto- do propuesto en el numeral anterior.

7. Desarrollar un método para mejorar el proceso de corte de muestras para obtener hojuelas más delgadas con el mismo espesor y ángulo de corte. Evaluar la posibilidad de realizar estos cortes con ayuda de controladores electrónicos para mejorar la calidad de los cortes.

8. Determinar el método más apropiado para fijar la membrana en el sopor- te, de modo que ella pueda sostener la hojuela en estudio.

9. Identificar el proceso más adecuado para la captura de imágenes y la formación del archivo en columna o stack de fotografías. Determinar la necesidad de emplear un marcador para fijar un sistema de referencia. 10. Desarrollar el software para acoplar el stack de fotografías como una re-

construcción tridimensional.

11. Validar el proceso de reconstrucción tridimensional desarrollado compa- rando sus resultados obtenidos con procesos ya reconocidos.procesa 12. Identificación de cualidades complementarias del programa VITRAL cuan-

do se emplea en la reconstrucción tridimensioal de otras muestras bioló- gicas.

2.3. LISTA DE CHEQUEO CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.

Capítulo 3

ANALISIS Y RESULTADOS

Como ya se anotó anteriormente, la reconstrucción tridimensional de imá- genes a partir de MET, objetivo central del presente trabajo de investigación, exigió la elaboración de un Mapa Conceptual y, con él, la construcción de un Diagrama de Flujo de las actividades a realizar; posteriormente, fue elaborada una lista de chequeo pormenorizada de estas actividades permitiendo así la organización de las tareas a desarrollar ya comentadas en la metodología.

Como resultado del plan de trabajo establecido también cada una de éstas etapas del proyecto fueron generando unos resultados parciales que, aunque no eran el núcleo central del trabajo, sí se constituyeron en parte integral del mismo.

3.1. De los equipos.

Como ya se mencionó, la primera labor consistió en la evaluación de los equipos disponibles, su funcionamiento, alcances y limitaciones. Como resul- tado de este proceso se obtuvo:

Se realizó todo el proceso de limpieza, ajuste y alineación del microscopio de luz LEICA ORTOPLAN el cual está dotado con los kits para miscrosco- pía de campo oscuro, para contraste de fase y fluorescencia; este equipo tiene como propiedad la posibilidad de trabajar con todo el espectro de luz visible y hace refringente o visible las partes translúcidas, como por ejem- plo las membranas celulares sin necesidad de realizar tinción; también tiene la propiedad de poder trabajar con muestras transluminiscentes y

3.1. DE LOS EQUIPOS. CAPÍTULO 3. RESULTADOS

epiluminiscentes; sin embargo, este equipo carece de cámara fotográfica. Este microscopio sirvió como instrumento esencial en el diagnóstico del camino óptico, identificando con él las partes más vulnerables a las inter- ferencias ópticas; además se identificaron las principales características de cada procedimiento de captura de imágenes a partir de un campo os- curo o de un contraste de fase, los proceso de calibración Köelher y el análisis de las posibles adaptaciones. Posteriormente, este mismo equi- po sirvió de soporte de inspección de muestras, es decir que, sobre él se construyeron los soportes que contenían la membrana con el propósito de tener las primeras imágenes que nos permitieran hacer seguimiento de las panorámicas de los tejidos que se utilizarían posteriormente. Como puede verse, este equipo fue esencial dentro del desarrollo del trabajo de investigación. Una vez se puso en marcha, se realizaron pruebas para de- purar la magnificación y el contraste. Con la adaptación de una cámara a un microcopio de luz.

También se contaba con un microscopio electrónico de transmisión, MET, marca JEOL 100B, en pésimo estado, dado que este equipo durante va- rios años permaneció fuera de servicio ; por ello fue necesario efectuar trabajos de róeparación del sistema hidráulico, de la detección de vacío y del sistema de regulación de alto voltaje; además, se implementó un siste- ma de recirculación de agua para mejorar la refrigeración necesario para conseguir baja presión y con ella un alto vacío. Este trabajo fue necesario hacerlo en virtud del alto poder de resolución del equipo indispensable para nuestra investigación, por cuanto ella, la resolución, depende solo de la alta diferencia de potencial en la columna del microscopio, es decir, de la energía de los electrones. Este microscopio sirvió como instrumento para capturar imágenes de ultraestructuras a magnificaciones de 50000X y resoluciones del orden de 5nm. Recordemos que estas imágenes de ca- da hojuela de la muestra se constituyeron en una parte fundamental del stack hacia la reconstrucción tridimensional de la muestra.

Otro dispositivo que hacía parte de los equipos iniciales del laboratorio fue una ampliadora de fotografías con brazo ecualizable y de graduación

CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.2. DE LAS MUESTRAS.

completa del organismo, un escorpión, una libélula y diversos insectos. Dentro de las modificaciones realizadas se le eliminó todo el sistema de captura de imágenes y se reemplazó por el sistema de lentes oculares; se le adaptó un soporte para fijar la cámara CMOS con la cual poder tomar una serie de fotografías en secuencia fija y con orientación esta- ble. Este equipo se empleó para obtener el primer nivel de acercamiento de una muestra, con la cual se obtenían imágenes que, posteriormente, iban a ser empleadas como elemento de verificación de la reconstruc- ción tridimensional obtenida. El esteroscopio también sirvió, más tarde, como soporte de la cámara que fue adaptada al microscopio de luz LEICA ORTOPLAN; este último montaje requirió el diseño de un sistema óptico adecuado para la captura de imágenes a través del microscopio de luz.

3.2. De las muestras.

Para insertarnos en el manejo de muestras se hizo necesario el estudio pormenorizado de los diferentes protocolos de manejo[5] y se reprodujeron al- gunos de ellos en la adecuación y procesamiento de las muestras para micros- copía electrónica de transmisión. Esto nos llevo a los siguientes resultados:

El estudio inicial de las diferentes metodologías de trabajo de las muestras nos llevó a determinar los procesos mas ádecuados en el alistamiento de una determinada muestra, figura( 3.1 en la página siguiente). Aquí se tuvo en cuenta el tamaño, el origen, la textura, la dureza, la adherencia y la densidad de las muestras para seleccionar el tipo de preparación más adecuada a las necesidades. Tambien se propuso la metodología de proporcionar reactivos por gotas y no por mililitros como se ha venido haciendo en los diferentes laboratorios y se propone como estandar en la literatura.[3].

A continuación se realizó un estudio de los diferentes procesos de corte de las muestras con el objeto de generar un protocolo propio de cortes para diferentes tipos de muestras. Este proceso nos permite realizar cor- tes con cuchillas aceradas, de vidrio, de diamante, sierras díiamantadas de diferentes espesores y crio-fractura. Además de estos cortes se aplicó

3.2. DE LAS MUESTRAS. CAPÍTULO 3. RESUL T ADOS Figura 3.1: Guia para la pr eparación de muestras de micr oscopía electrónica : La or ganización conceptual, muestra en la figura la integración de pr ocesos sobr e la pr eparación de muestras micr oscopía electrónica de transmisión[5], relaciona globalmente las actividades y per mite visualizar o hacer ajustes para un pr oceso específico durante la mar cha. Pr opuesta metodológica elaborada en el Centr o de Micr oscopia de PUJ. 32

CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.2. DE LAS MUESTRAS.

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Figura 3.2: Procesos de cortes para obtener imágenes:

Las imagenes indican las diferentes técnicas de obtención de cortes: A, B y C. Preparación de muestras para obtener superficies por el método de raspado; en C, se incluyen las guias para orientación de las superficies. D. Corte de diente realizado con disco diamatado de espesor0_,3_mm. a 2500 r.p.m y refrigeración por agua. E. corte de diente

utilizando criostato posterior a la descalcificación con acido nitrico al 5 % y coloración con hematoxilina de Mayers. F. Sección de corte con microtomo de espesor de25_µm, observado en el microscopio confocal FV1000 de Olympus a

40X. G y H. Metodo de crifractura para observar tubos dentinarios, micrografia a 4000X obtenida en el SEM Quanta 200 de la Universidad Nacional de Colombia y posterior análisis de imagenes con el software libre Image J. I, J y K. Cortes seriados de sinapsis interneural realizados con el ultramicrotomo sorval MT-1, de espesor de60_nmvistos al

microscopio electrónico de transmisión a 50000X. Procesos desarrollados en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.

otro método, utilizando el sistema de raspado con el objeto de conseguir superficies más delgadas. Estos cortes son posibles sobre muestras con- tinuas o discretas (colonias de bacterias), sobre muestras sólidas, como minerales (vidrio), oseas (dientes), queratinizadas (caparasones) y en ve- getales; y también, sobre muestras de cultivos celulares.

Dado que la captura de una imágen de la hojuela proveniente de una muestra no puede ser orientada previamente para facilitar su posterior re- construcción, se hizo necesario introducir un sistema de referencia propio

3.3. DE LA CÁMARA FOTOGRÁFICA. CAPÍTULO 3. RESULTADOS

que nos facilitara este proceso. Esto se logró incluyendo guías de orien- tación como puntos, círculos, líneas, barras u otras señales externas y distintas al espécimen, figura( 3.2 en la página anterior).í

La importancia de desarrollar estos procesos radica en la necesidad de pre- servar la morfología e histología de la muestra de modo que no se altere su biometría y composición. Adicionalmente, la estandarización de estos procesos permite caracterizar muchos materiales de la naturaleza. Además, la introduc- ción de guías de referencia ahorra posterior trabajo de ajuste de las imágenes mediante el sotware de alistamiento.

3.3. De la cámara fotográfica.

La captura de imágenes procedentes de los microscopios hizo necesario el análisis, evaluación, ajuste al presupuesto, implementación de un proyecto y, finalmente, compra de este equipo. Con ello se obtuvieron los siguientes resultados:

Después de un proceso como el ya narrado se logró la adquisición de la cámara digital Sony SR-1 de 10.3 megapixeles con tecnología CMOS. Este tipo de cámara resultó favorecida en el proceso de selección porque su tecnología permite la captura completa de cada pixel de color[1]. La utilización de la cámara exigió adecuación de la distancia óptica; y hacer coincidir la distancia focal de la cámara con el área de captúra de la imagen. Esto se logró diseñando las lentes delgadas adecuadas, mandandolas a pulir en una fábrica y realizando el montaje respectivo. Eaplicó cadal sistema óptico se complementó con otra lente compuesta para extender la distancia focal hasta el infinito. Adicionalmente le fueron adecuadas lentes intermedias para la corrección de la aberración croma- tica, generadas por la esfericidad de la lente pulida. Es de anotar que la corrección se logró con baño de oxidos metalicos sobre la superficie de las lentesproceso que no es puede realizar en el país por carencia de la

CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.3. DE LA CÁMARA FOTOGRÁFICA.

Figura 3.3: Piezas sistema de adaptación óptica:

Sistema óptico diseñado para la adquisición de imágenes en el microscopio de transmisión JEOL 100B. Cuenta con un vidrio de agujero central para acoplar el objetivo de la cámara formado por 4 lentes , dos de enfoque y dos de corrección cromática. Diseñado y contruido en el Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.

A pesar de ser una actividad distinta a la óptica asociada a la cámara foto- gráfica, sí está relacionada con ella, por la necesidad de diseñar, construir e implementar todo un sistema de ensamblaje del conjunto de lentes de la cámara. Inicialmente se realizó un diseño que luego fue moldeado con re- sinas sintéticas de tipo poliester; más tarde, fueron pulidas las roscas de giro requeridas y las guías de ajuste y separación de lentes y, finalmente, las lentes fueron ajustadas a presión, garantizando la invariabilidad de los centros ópticos y su posible desarme para ser implementado en otros microscopios, si así fuera requerido.

Este equipo fue importante en el desarrollo del proyecto porque permitió el proceso de adquisición de imágenes de alta calidad. Los dos últimos pasos descritos anteriormente contribuyeron en la captura de una imagen completa y enfocada de la superficie de una muestra y posibilitaron eliminar las aberra- ciones cromáticas generadas por las barras laterales de las rejillas de soporte.

3.4. SOBRE LA CÁMARA CAPÍTULO 3. RESULTADOS

3.4. De la adecuación de la cámara a los micros-

copíos.

Una vez capturadas las imágenes procedentes de los microscopios se hizo necesario el procesamiento de la información digital proveniente de la cámara fotográfica. El alto costo asociado con el proceso de revelado y al tiempo reque- rido para ello, exigieron el manejo de un software comercial para recolección, orientación y almacenamiento en formato de datos de las diferentes fotogra- fías. Una muestra procesada puede contener más de 200 fotografías y podría llegar a un número cercano a las 1000. Con este proceso se obtuvieron los siguientes resultados:

Para evitar la oscuridad externa requerida en el MET, generadas por re- flexiones que alteraban la información proveniente de la pantalla, se en- sambló el sistema óptico incrustándolo en una placa maciza y opaca del tamaño de la ventana del microscopio sellando toda posibilidad de ingre- so de rayos de luz al interior de la zona de trabajo, (figura 3.4 en la página siguiente).

Para evitar efectos de dispersión, difracción y reflexión al interior del mi- croscopio, generados por la luz emitida por la fluorescencia de la pantalla se cambió el vidrio principal y original por otro de idénticas características pero con un agujero en la zona de ubicación del sistema óptico (figura 3.3 en la página anterior). Sin embargo, las bajas presiones a la que queda- ba expuesta la lente delgada debido a las condiciones de vacío obligaron a adaptarle una lente adicional concavo-convexa, de identica curvatura asegurando la conservación de la distancia focal. Esto premitió soportar, con seguridad, las bajas presiones del interior del microscopio.

Las huellas que aparecían en las fotografías debidas al deterioro de la pantalla, exigieron la reconstrucción de la pantalla fosforescente con lo cual se lograron imágenes más definidas por las características renovadas

CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.4. SOBRE LA CÁMARA

Figura 3.4: Ensamble sistema de adaptación óptica:

La figura muestra los pasos para el montaje de los lentes que arman el objetivo de la cámara y la asegura en el vidrio de la ventana del microscopio mediante el adaptador cilindrico que aparece en la imagen F. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana

Figura 3.5: Testigos de ancho de banda fosforescente para haz de electrónes.

Las placas en la parte superior actuan como testigos, comprobación de la respuesta de fosforescencia para la radiación UV larga y corta. Al observar el testigo: A. Iluminación con luz día, no presenta fosforescencia. B. Excitación con UV de longitud de onda larga, no hay respuesta. C. Excitación con UV de longitud de onda corta, el testigo fluoresce. La pantalla es fosforescente en todo el espectro de UV después de su reconstrucción, imágenes de la pantalla en B y C. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.

3.4. SOBRE LA CÁMARA CAPÍTULO 3. RESULTADOS

Figura 3.6: Sistema de adquisición de imágenes digitales para MET:

Cámara digital adaptada al microscopio electrónico de transmisión JEOL 100B. Monitorea la imagen sobre la pantalla fosforescente en el microscopio y evita cualquier incidencia de luz de exterior hacia el interior. Centro de Microscopía Electrónica, Pontificia Universidad Javeriana.

Los procesos de adaptación de la cámara nos eliminaron la posibilidad de observar la muestra por el aislamiento de todo el montaje. Esto hizo necesario implementar un sistema de seguimiento y selección de la zona de interés. Para ello se adquirió una tarjeta capturadora de video que, introducida en un computador, permitiera, a través de la misma cámara, monitorear la ubicación del haz de electrones sobre el espécimen y así delimitar la ultraestructura de interes. (Figura 3.6).

Esta adaptación de la cámara digital al MET aportó al proyecto los siguientes beneficios: se posibilitó obtener imágenes de alta calidad en formato digital, se logró disminuir el tiempo de procesamiento al evitar el revelado de las imáge- nes y su consiguiente escaneo, se pudo aumentar el número de exposiciones fotográficas y, a partir de ellas, determinar aquella o aquellas que nos entre- garan la imágen más definida, lo cual significó un ahorro efectivo en tiempo y material.

La disposición de la cámara sobre el microscopio facilitó la manualidad y visualuzación directa de los archivos fotográficos posibilitando una posterior

CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.5. INTERFERENCIAS ÓPTICAS

de oscuridad total en el lugar de trabajo del MET y se hicieron más eficientes las condiciones de oscuridad al interior del microscopio.

Un aporte adicional de la adecuación de la cámara y su ensamblaje al mi- croscopio fue la posibilidad de emplear todo el sistema óptico diseñado[10], tanto en el MET como en el microscopio de luz y en el esteroscopio.

3.5. De la eliminación de interferencias ópticas

indeseadas.

Una dificultad adicional que se presentó en el proceso de observación de muestras inmersas en el microscopio de luz, debido a la necesidad de acercar el lente objetivo a la muestra y que se puede convertir en una seria dificultad en la reconstrucción tridimensional de una muestra, consiste en la presencia de elementos de interferencia óptica ajenos a los provenientes de la muestra. Estos elementos hacen referencia a una posible suciedad en alguna zona del espacio de trabajo, a la presencia de imperfecciones sobre la superficie de los materiales utilizados o de contaminaciones provenientes del medio. También a fenómenos ópticos, reflexión, refracción, difracción, presentes en los vidrios porta y cubre-objetos. Para solucionar estos impases se desarrolló un proceso