Métodos de Diagnóstico

Métodos Bacteriológicos. Generalmente los cultivos bacteriológicos son los métodos más usados para conocer la presencia o no de una bacteria, en este caso fueron para Salmonella spp, Pseudomona spp., Escherichia Coli, Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens.

Medios de cultivo. La elaboración de medios de cultivo se hace con el fin de que haya un crecimiento y desarrollo de los microorganismos, esta mezcla debe ser equilibrada en cuanto a los nutrientes y concentración requeridos que permitan un buen crecimiento.

Preparación de los Medios de Cultivo

• Agua peptonada al 0.1%. Se usa para el crecimiento previo no selectivo de bacterias, un enriquecimiento previo en este caldo conduce a mayores cuotas de crecimiento de enterobacterias patógenas. El caldo rico en sustancias nutritivas provoca una alta sobrevivencia de bacterias y un crecimiento intenso.

Para la preparación del agua peptonada se disuelve 0.234 g de peptona en 234 ml de agua destilada, se distribuye en tubos (9 ml) y frascos (90 ml) y se esteriliza en la autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Luego se siembra con material de muestra (en este caso muestra de agua) y se incuba por 18 horas a 37°C. Posteriormente se siembra en agares selectivos.

• Plate Count. Este medio se usa para el crecimiento de bacterias mesófilas. Para la preparación del medio se agregan 22,5 g por cada litro de agua destilada; se deja hervir durante 2 – 3 minutos y se lleva al autoclave a 121°C por 15 minutos; después se realiza la siembra de la muestra, en donde se toma 1 ml de la muestra y se agrega en la caja petri totalmente esterilizada,

posteriormente se vierte el plate count dejando enfriar para luego llevar a incubación.

• OGY (oxitetraciclina, glucosa, levaduras). Este medio se usa para el crecimiento de hongos y levaduras, especialmente Candida albicans y Aspergillus Níger. Se prepara 30 g por cada litro de agua destilada; se deja hervir durante 2 – 3 minutos y se lleva al autoclave a 121°C por 15 minutos; después se vierte en cajas petri previamente esterilizadas.

• Salado Manitol (SM). Este medio se usa para el crecimiento de Staphylococcus aureus. Este se prepara con 108 g por cada litro de agua destilada; se deja hervir por 2 – 3 minutos y se lleva al autoclave a 121°C por 15 minutos; después se vierte en cajas petri previamente esterilizadas.

• EMB (Eosyne Metilene Blue). Este medio se usa para el crecimiento de Escherichia Coli. Se prepara 36 g por cada litro de agua destilada; se deja hervir durante 2 – 3 minutos y se lleva al autoclave a 121°C por 15 minutos; después se vierte en cajas petri previamente esterilizadas.

• Cetrimide. Este medio se usa para la identificación de Pseudomona spp. Se agrega 44.5 g por cada litro de agua destilada; se deja hervir por 2 – 3 minutos y se lleva al autoclave por 15 minutos a 121°C; antes de agregar el medio en las cajas petri, se agrega glicerina a razón de 10ml por cada 1000 ml de agua destilada; esto con el objeto de si hay un crecimiento se verán fluorescentes mediante una luz violeta.

• TSN (Tioglicolato sulfito neomicina). Este medio sirve para la identificación de Clostridium perfringens. Se prepara a razón de 40 g por cada litro de agua destilada; se deja hervir por 2 – 3 minutos y se lleva al autoclave a 121°C durante 15 minutos; después se vierte en cajas petri previamente esterilizadas. • Bismuto Sulfito (BS). Este medio se usa para el crecimiento de Salmonella

spp. Se prepara con 47.5 g por cada litro de agua destilada. Se deja hervir por 2 – 3 minutos e inmediatamente se vierte en las cajas petri previamente esterilizadas.

• Triptófano. Este medio se usa para confirmar el crecimiento de coliformes fecales, acompañado con la siembra de EMB. Se prepara al 5% de agua peptonada. Este se vierte en tubos (5 ml) y se lleva a la autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

• Caldo Brila. Este medio sirve para el crecimiento de coliformes totales. Se prepara a razón de 40g por cada litro de agua. Se agrega a los tubos (9 ml) y se lleva a la autoclave por 15 minutos a 121°C. (Orozco y Rodríguez, 1999)

Siembra. Para la siembra se utiliza un asa redonda, la cual se esteriliza con la ayuda del mechero, luego se toma la muestra, luego la caja y se distribuye en rejilla una sola vez, esto en los medios de cultivo sólidos y para los medios de cultivo líquidos se siembra distribuyendo en el fondo del tubo se agita y gira.

Lectura. Para la lectura de los diferentes microorganismos analizados se tiene en cuenta el crecimiento de las colonias y el color de estas que indica la presencia o ausencia del microorganismo:

Para realizar la lectura de los coliformes totales se utilizó la técnica de recuento bacteriano:

Tabla 16. Forma de lectura de los diferentes microorganismos analizados

Microorganismo Presencia E. coli Pseudomona spp. Salmonella spp. Clostriium P. Staphylococcus A. Hongos y levad.

Colonias de color violeta-verde

Colonias de color verde oscuro-fluorescentes Colonias de color negro

Colonias de color negro Colonias de color amarillo Colonias: Mohos color gris

Recuento Bacteriano. Se utiliza para conocer la concentración de bacterias que hay en una muestra, en este caso agua. También se usa para saber si existe alguna contaminación por parte de microorganismos denominados indicadores de calidad:

• Coliformes: Las bacterias coliformes son aeróbicas o anaeróbicas facultativas, no forman esporas, son Gram negativas. La especie principal de este grupo es:

Escherichia coli: Generalmente no patógenas, habitan el tracto intestinal de los animales

El método más usado para la determinación de coliformes es el método de los tubos múltiples. El procedimiento para un tubo es:

9 Esterilización en autoclave a 121ºC por 15 minutos. 9 Adición de la muestra.

9 Incubación a 35ºC por 48 horas.

Para determinar los resultados de los coliformes totales se observa la ausencia o presencia de gases en la campana de Durhan.

Los resultados positivos obtenidos, se ingresan a la tabla (Anexo K) de probabilidades que entrega el número más probable de coliformes por 99 ml de la muestra original (NMP/99 ml).

Para la lectura de los aerobios mesófilos se utilizó la técnica de recuento viable:

Recuento viable. Este método se utiliza para contar en forma directa la cantidad de colonias que existen. Esta se realiza por medio de diluciones logarítmicas.

El recuento estándar en placa y recuento aeróbico en placa, se siembran diluciones adecuadas de una muestra en medios de agar que contienen nutrientes suficientes para permitir el crecimiento del mayor número posible de microorganismos.

Las células bacterianas individuales, transferidas a la placa con el diluyente, se multiplican normalmente durante la incubación. Así puede hacerse una estimación del número total de células viables (es decir, células capaces de crecer en el medio de recuperación) en la dilución sembrada, calculando después de la incubación el recuento del número total de colonias bacterianas que se desarrollan. La enumeración de las colonias se lleva a cabo tradicionalmente de forma manual, en donde se cuenta cada colonia individual. (http://coli.usal.es)

Materiales y Equipos

• Incubadora • Refrigerador

• Cajas de Petri estériles • Pipetas de 1ml estériles • Pipetas de 10 ml estériles • Gradillas

• Probeta plástica

• Beaker plástico de 2000 ml • Tubos tapa rosca estériles • Cuenta colonias

• Pipeteador Frascos estériles de 100 ml

• Asa de inoculación • Mechero

• Balanza de tres brazos

• Espátulas, guantes, pinzas, tijeras • Nevera de icopor

• Medios de cultivo • Agua destilada estéril • Agua peptonada • Horno

• Papel kraft • Autoclave

Análisis de la Biocapa. Para el análisis de la biocapa se tuvo en cuenta el ensayo realizado por Ricardo Vegas, Médico Veterinario – Jefe de productos Area Aves y Cerdos de Swiss Agro.

En este ensayo Vegas quiso mostrar la presencia de la biocapa en el circuito de agua, por lo tanto iniciaron el ensayo tomando dos muestras de agua en dos puntos distintos de la red de tuberías que suministran el agua; estas muestran fueron:

Muestra 1: Agua a la entrada del tanque de suministro del galpón proveniente de pozo profundo.

Muestra 2: Agua de la manguera del bebedero al otro extremo del mismo galpón.

Después de que las muestras fueron analizadas, el procedió a tratar el circuito de agua con un producto comercial, que combina ácido peracético, peróxido de hidrógeno, ácido acético, sufactantes y estabilizantes.

El agua tratada con ese producto lo dejó por un tiempo de 2 horas, posteriormente, procedieron a descartar el agua tratada y luego a lavar con abundante agua limpia; después tomaron una muestra en el agua de la manguera del último bebedero y lo remitieron para análisis bacteriológico.

Por lo tanto para este proyecto se decidió realizar el mismo procedimiento para conocer si existía la presencia de la biocapa; y, también se trató el agua con un producto comercial, en este caso el peróxido y así saber si era eficaz en el eliminación de la biocapa.