Métodos para la deteccion de dopaje con hGH recombinante

Aunque su uso continua estando prohibido por la máxima autoridad anti- doping, actualmente, la Agencia Mundial Antidopaje (AMA), así como por la mayor parte de organismos deportivos internacionales, la hGHr sigue considerándose hoy día una de las sustancias más utilizadas para mejorar el rendimiento deportivo. Sin embargo, el desarrollo de un método fiable y sensible para la detección del dopaje con hGHr, ha sido y continúa siendo el objetivo de muchos estudios, de manera que las pruebas rutinarias de los controles anti-doping actuales no incluyen un test para ello y los métodos desarrollados hasta el momento son principalmente utilizados para investigación [4]. Puesto que los niveles de concentración de hGH en orina son el 0,1-1% de los encontrados en sangre, este tipo de muestra se utiliza con más frecuencia en la detección de hGHr [26]. Son varias las razones que hacen tan complicada la detección de la hGHr. En primer lugar la hormona recombinante es estructuralmente idéntica a la isoforma 22K nativa, lo que las hace analíticamente indistinguibles. Por otro lado, como se ha comentado anteriormente, existe una amplia fluctuación fisiológica de los niveles de concentración de la hormona en sangre, debido a la naturaleza pulsátil de su secreción y a la influencia que numerosos factores externos ejercen sobre estos. Además la vida media de la hGH circulante limita la detección de la hormona a un corto periodo de tiempo. Todos estos factores hacen imposible conocer si ha existido administración de hGHr a partir de una simple cuantificación de la concentración de la hGH total o de la hGH 22K, y convierten el desarrollo de un test robusto para detectar el uso fraudulento de la hGH en el deporte, en uno de los mayores desafíos en la lucha contra el dopaje [27, 28].

Para abordar estos problemas se han investigado principalmente dos estrategias alternativas, un método directo de detección de hGHr, del cual han surgido distintas variantes, y un método indirecto [29]. La estrategia de detección directa del dopaje con hGHr, denominada “método de las isoformas”, se basa en la abundancia relativa de la variante 22K en comparación con las otras isoformas, tras la administración de hormona. Como se comentó anteriormente el aumento de los niveles de hGH conlleva un aumento de IGF-I cuya presencia en plasma inhibe la liberación de la hormona debido a un

mecanismo de regulación por retroalimentación negativa. De esta forma la disminución de los niveles circulantes de todas las isoformas de la hGH pituitaria (de origen endógeno), fracción denominada pit-hGH, resulta en una elevación de los niveles de hGH 22K que corresponde a la hGHr administrada, fracción denominada rec-hGH. El método, desarrollado y patentado por Strasburger y col. [30] consiste en la realización de dos inmunoensayos, uno para determinar exclusivamente los niveles de rec-hGH, y otro ensayo para determinar la fracción pit-hGH. El primer ensayo utiliza como anticuerpo captura un anticuerpo monoclonal que presentan una alta afinidad por la hGH 22K y en el segundo ensayo el anticuerpo captura presenta baja afinidad por esta isoforma. Un tercer anticuerpo monoclonal es utilizado como anticuerpo de detección en los dos ensayos. De esta manera, el cálculo de la relación rec- hGH:pit-hGH permite la determinación de la abundancia relativa de la variante 22K, y, por tanto, de la hGHr administrada (Figura 20).

hGH 17K hGH 20K hGH 22K mAc hGH (2) mAc hGH (1) mAc hGH (2) mAc hGH 22K

Figura 20 Inmunoensayos realizados con el método de las isoformas basado en el cálculo rec hGH:pit hGH. La relación entre la concentración de hGH 22K, (izq.) determinada en un primer ensayo, y concentración de hGH total, (dcha.) determinada en un segundo ensayo, permite detectar el dopaje con hGHr.

La posterior disponibilidad de un anticuerpo altamente específico para la isoforma hGH 20K ha permitido el desarrollo de una variante del método que se basa en la determinación de la relación hGH 22K: hGH 20K en plasma (Figura 21). Esta relación es aproximadamente de 9:1 y parece ser independiente del sexo, edad, ejercicio físico e incluso ciertas patologías [31]. El notable incremento de esta proporción tras la administración de hGHr ha sido descrito en varios estudios de dopaje, sugiriendo este parámetro como el indicador más apropiado para la detección de dopaje con hGHr [32], aunque aún no se han comparado ambas estrategias de detección de dopaje con hGHr. Sin embargo, debido a la corta vida media de la hGHr en sangre, las dos variantes del método de las isoformas están limitadas a las primeras 3-5 o 24- 48 horas tras la administración de la hormona, dependiendo de si es

administrada por vía intravenosa (pico máximo a las 60 min) o intramuscular (pico máximo a las 2-6 h), respectivamente [20].

hGH 22K

hGH 20K

mAc hGH 22K (1)

mAc hGH 22K (2) mAc hGH 20K (2)

mAc hGH 20K (1)

Figura 21 Inmunoensayos realizados con el método de las isoformas basado en el cálculo hGH 22K:hGH 20K. La relación entre la concentración de hGH 22K, (izq.) determinada en un primer ensayo, y concentración de hGH 20K, (dcha.) determinada en un segundo ensayo, permite detectar el dopaje con hGHr.

El segundo método empleado actualmente para el desarrollo de un test anti-doping es un método indirecto de la medida de la concentración plasmática de la hGHr, que amplía la ventana de detección de la misma. Este método se basa en evaluar los efectos fisiológicos de la hormona que producen una elevación de los niveles circulantes de proteínas del eje IGF-IGFBP, con mayor vida media (de 90 a 500 h) y niveles de concentración en plasma más estables que la hGH [33]. La determinación de los niveles circulantes de estas proteínas, constituyen la base de este segundo método de detección de dopaje con hGH [27]. Aunque los niveles plasmáticos de estas proteínas en un individuo se mantengan más estables que los de la hGH, existe sin embargo una amplia variación de los mismos entre individuos dependiendo de la edad, género, peso corporal, actividad física, dieta y etnia entre otros factores [34]. Esta variabilidad interindividual dificulta la definición del nivel de corte a partir del cual sea probable que se haya producido un dopaje con hGH [35]. Además existe una gran heterogeneidad en los anticuerpos empleados, por lo que la implementación de este método depende en gran medida de poder establecer inmunoensayos estandarizados [36].

Entre los métodos de detección directa de la hGHr las técnicas más utilizadas se basan en inmunoensayos tipo sándwich que pueden ser enzimáticos (ELISA), inmunofluorimétricos (IFMA), o inmunoquimioluminométricos (ICMA). La sensibilidad que puede alcanzarse con estas técnicas es aproximadamente de 2 pg/mL [4]. Para la determinación de proteínas dependientes de la hGH (método indirecto de detección de hGHr) las técnicas más empleadas son RIA, ELISA y sistemas autoanalizadores de inmunoensayos [37].

e) b) a) Biotinilación de la SAM Formación de la SAM Superficie de Au d) Inmovilización del mAc hGH-12 c) Inmovilización de estreptavidina f) Unión de la hGH 22K y 20K al mAc hGH-12

Unión del mAc hGH- 25 y hGH-33

Figura 22 Representación esquemática del método empleado para la determinación de las isoformas hGH 22 y 20K. a) Formación de la SAM, (b) biotinilación de la SAM, (c) inmovilización de estreptavidina, (d) inmovilización del anticuerpo mAc hGH-12 biotinilado, (e) unión de las isoformas de la hGH y (f) detección de la hGH 20 y 22K mediante el reconocimiento por los anticuerpos selectivos mAc hGH-25 y mAc hGH- 33.

3.2. Ensayo de detección de las isoformas hGH 22K y hGH