Reutilización de la superficie de mAc hTSH-

Cuando el anticuerpo se inmoviliza, en su forma nativa, a través de su unión por afinidad a una proteína, como es el caso de la proteína G, la reutilización de la superficie de anticuerpo está limitada por el tipo de unión que se establece entre la proteína receptora y el anticuerpo. Debido a que la unión entre la proteína G y un anticuerpo son de la misma naturaleza físico-química que las que mantienen unido el anticuerpo a su antígeno específico, y que ambas interacciones presenta una afinidad similar (Ka 108-109) [13, 14], cualquier tampón utilizado para la ruptura de la unión Ag-Ac afectaría igualmente a la

unión del anticuerpo a la proteína orientadora, perdiéndose anticuerpo de la superficie. Los procedimientos empleados para poder regenerar la superficie sensora en estos casos hacen uso de una reacción de entrecruzamiento mediada por una molécula denominada entrecruzador (crosslinker), capaz de generar enlaces covalentes entre ambos. El principal problema que presenta el uso de crosslinkers, es que reaccionan con grupos funcionales que pueden estar presentes tanto en el anticuerpo como en la proteína de unión al mismo, por lo que pueden generar uniones dentro de las mismas moléculas, y por tanto, alterar su funcionalidad.

Para poder reutilizar la superficie funcionalizada con mAc hTSH-2, se llevó a cabo un procedimiento de entrecruzamiento (crosslinking) mediante el uso del compuesto BS3 (bis-(sulfosuccinimidil)-suberato), que reacciona con los grupos amino de las proteínas para establecer enlaces amida. Con la intención de minimizar la posible alteración de la funcionalidad del anticuerpo debido a la reacción de entrecruzamiento, se optimizó la concentración de BS3 con el objeto de determinar la concentración más baja posible que permitiera que la unión entre el mAc hTSH-2 y la proteína G no resultara afectada por el proceso de regeneración de la superficie. Puesto que no se conocían las condiciones del tampón de regeneración que permitieran romper la unión hTSH–mAc anti-hTSH, preservando lo más posible la estabilidad del anticuerpo, estas se optimizaron previamente al estudio de la concentración de BS3. Este proceso se llevó a cabo utilizando el sistema biotina/estreptavidina, que garantiza la unión del anticuerpo a la superficie durante el proceso de regeneración. Las soluciones de regeneración que se ensayaron fueron HCl 5 mM y Gly 50 mM/HCl pH 2,8. El HCl 5 mM se escogió porque fue la solución empleada en el trabajo con la hGH, y había funcionado exitosamente. La glicina de pH 2,8 se escogió porque había sido utilizada como tampón de elución en la purificación del mAc hTSH-2, y había resultado el tampón más eficiente en la ruptura de la unión del anticuerpo a la columna de proteína G, empleando las condiciones menos extremas posibles. Tras la unión de la hTSH (inyectada en PBST pH 7,4 a una concentración de 1 µg/mL) a la superficie de mAc hTSH-2, preparada mediante el método basado en el sistema biotina- estreptavidina utilizado en el inmunoensayo descrito en el apartado 4.4, se fluyeron las soluciones de HCl 5 mM y Gly 50 mM pH 2,8, en celdas independientes, durante 30 segundos y manteniendo el flujo de PBST a 30 µL/min. Posteriormente se inyectó de nuevo la misma solución de hormona. Como se observa en la Figura 45, tras el paso de las dos soluciones de

regeneración se recuperó el nivel de señal SPR original, previo a la inyección de ambas. Sin embargo, la respuesta de la superficie en la detección de la hTSH tras utilizar ambas soluciones fue distinta, de manera que aquella donde se empleó HCl 5 mM, dio lugar a una señal de detección menor de la observada en la primera inyección de hormona, mientras que la superficie regenerada con Gly 50 mM pH 2,8 dio lugar a la misma respuesta. Aunque las dos soluciones empleadas produjeron la ruptura total de la unión de la hTSH al anticuerpo recuperándose la señal SPR basal, este resultado indica que la solución de HCl 5 mM es demasiado agresiva en cuanto a la estabilidad del anticuerpo se refiere y no permite reproducir la respuesta en el siguiente ciclo de medida de la hTSH, mientras que el tampón de glicina no afecta a la estabilidad de la superficie biofuncionalizada con mAc hTSH-2. Puesto que con esta solución se consiguió regenerar la superficie sin reducir su eficiencia, se seleccionó para el desarrollo del inmunoensayo.

Figura 45 Sensorgrama correspondiente a dos ciclos de medida de hTSH utilizando distintas condiciones de regeneración.

Posteriormente se procedió a la optimización de la concentración del BS3 utilizando la Gly 50 mM pH 2,8 para regenerar la superficie. Las instrucciones del fabricante del reactivo sugieren que para concentraciones de anticuerpo mayores de 5 mg/mL debe emplearse una cantidad del reactivo 10 veces superior, mientras que para una concentración inferior se recomienda utilizar de 20 a 50 veces mayor cantidad de BS3. Puesto que la concentración de mAc hTSH-2 a inmovilizar era de 3 órdenes menor (10 µg/mL), se optó por empezar estudiando el efecto de concentraciones de crosslinker en un intervalo de relación molar Ac:BS3 por encima de 1:50. Se prepararon tres superficies

sensoras con la proteína G, utilizando las condiciones óptimas descritas en el apartado 4.5.1. Tras el acoplamiento del mAc hTSH-2 sobre cada superficie de proteína G, se realizó el procedimiento de crosslinking según las instrucciones del fabricante y ensayando las relaciones molares Ac:BS3 1:100, 1:500 y 1:1000. Seguidamente se fluyó sobre cada superficie de anticuerpo la solución regeneradora para evaluar la eficiencia del mismo.

Figura 46 El sensorgrama muestra la regeneración de las monocapas de mAc hTSH-2 obtenidas variando la concentración de BS3, tras la unión de la hTSH.

Como se observa en la Figura 46 la mayor relación molar Ac:BS3 ensayada, 1:1000, fue la única con la que se consiguió que no se perdiera mAc hTSH-2 unido a la monocapa de proteína G, por lo que fue la relación óptima seleccionada para la reutilización de la superficie. En el sensorgrama de la Figura 47 se muestra la repuesta a lo largo de tres ciclos de medida. Se puede observar como la sensibilidad del inmunoensayo no resulta afectada por el uso del crosslinker, y como el sistema de regeneración permite la reutilización de la superficie al menos durante tres ciclos de medida sin alterar la funcionalidad de la misma.

Figura 47 Sensorgrama obtenido realizando cuatro medidas de detección de 1 µg/mL de hTSH con la misma monocapa de mAc hTSH-2.