Materiales y métodos 1 Hongos Filamentosos.

En este capítulo se emplearon los hongos A. flavus AFUNQ6, cedido por la Universidad Nacional de Quilmes (UNQUI, Argentina) y A. flavus AFUNL1, AFUNL2 y AFUNL3, cedidos por la Universidad Nacional del Litoral (UNL, Argentina). Los hongos se conservaron y activaron como se describió en materiales y métodos generales.

5.3.2 Medios de cultivo de los hongos filamentosos.

Los hongos se conservaron en Agar Agua (0,2%) a 4 ºC, se cultivaron en Agar PDA-papa dextrosa (Merck®, Darmstadt, Alemania) y se prepararon las soluciones de conidios de acuerdo a los materiales y métodos generales.

5.3.3 Obtención de las soluciones de conidios.

Las soluciones de conidios empleadas en este capítulo se prepararon según materiales y métodos generales.

5.3.4 Ensayos de Inhibición del crecimiento fúngico.

La inhibición del crecimiento fúngico se estudió mediante el método de difusión en agar en medio malta (Anexo 1) como se describió en materiales y métodos generales. El medio de cultivo estéril se mezcló con ácido láctico (Carlo Erba®, Italia) en el rango de 11,9–357,7 mM o ácido acético (Merck®, Darmstadt,

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Alemania) en el rango de 13,0–41,6 mM o con mezclas de ambos ácidos. Las concentraciones de ácidos examinadas correspondieron al máximo permitido por Código Alimentario Argentino (CAA, 2006) para la cerveza de 3% de ácido láctico y 0,5% de ácido acético. También se consideraron los niveles indicados por Davidson (2001) de ácido láctico entre 0,2 y 2,5% para inhibir hongos filamentosos.

Los hongos filamentosos se cultivaron, diluyeron e inocularon según materiales y métodos generales. Para el control se consideró el medio de cultivo malta sin adición de ácidos. Las curvas de crecimiento, regresiones lineales y el cálculo de los parámetros cinéticos tasa de crecimiento KD (mm/h), duración de la fase de

latencia Lag (h) y los índices de inhibición de la tasa de crecimiento IIKD (%) y de

incremento de la fase de latencia, IILag (%) se calcularon según materiales y métodos generales. En este capítulo, dado que se encontraron los mayores incrementos de fase Lag, también se determinó la siguiente relación: LagT/LagC, donde LagT y LagC corresponden a las fases de latencia obtenidas en los experimentos de crecimiento fúngico tratados con los ácidos y el control respectivamente. IIKD adquiere valores de 100% cuando KD del tratamiento es

igual a 0 y el hongo permanece en la fase de latencia durante todo el tiempo de incubación. IIKD es 0 cuando la tasa de crecimiento de los hongos tratados y los

correspondientes controles muestran el mismo ritmo de crecimiento (KDC = KDT).

IIKD varía de 0 a 100% debido a la acción conservante de los ácidos orgánicos.

5.3.5 Cálculo de la concentración de ácidos orgánicos no disociados.

El cálculo de la concentración de ácidos láctico y acético se realizó como se describió en Materiales y Métodos generales.

5.3.6 Determinación de la CIM (concentración inhibitoria mínima) y CIC (concentración inhibitoria fraccionaria)

La concentración inhibitoria mínima (CIM) de los ácidos láctico y acético aplicados en forma individual y en mezclas binarias se definió como la concentración mínima probada que inhibió el crecimiento de A. flavus durante 20

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días. Las diferentes CIM halladas se transformaron en concentración inhibitoria fraccionaria (CIF), según Davidson Parish (1989) y López-Malo, Barreto- Valdivieso, Palou, & San Martín, 2007), según las siguientes fórmulas.

CIFláctico = (CIM ácido láctico en presencia de ácido acético)/(CIM láctico solo) Ecuación 5.2

CIFacético = (CIM ácido acético en presencia de ácido láctico)/(CIM acético solo) Ecuación 5.3

La sinergia generada por la mezcla de ácidos puede ser expresada en forma matemática por medio de la concentración inhibitoria fraccionaria CIF, que se calcula a partir de valores de CIM para cada uno de los ácidos orgánicos como sigue:

CIFíndice= CIFláctico + CIFacético Ecuación 5.4

Esta relación puede ser interpretada de la siguiente manera:

- Si la relación entre el ácido láctico y acético es aditivo, la suma de los valores de CIF en la ecuación 5.4 es 1.

- Asimismo, si la interacción entre el ácido láctico y acético es sinérgica la suma esperada de los CIF es inferior a 1.

- La relación es antagónica si la suma de las fracciones es mayor a 1 (Adams & Hall, 1988; Dickson Maynard, 1992; Rubin, 1978; Berenbaum, 1977).

5.3.7 Fabricación de la Arepa y determinación de la estabilidad del alimento adicionado de ácidos orgánicos puros (láctico y acético)

Para determinar el efecto de los ácidos orgánicos en la vida útil de la arepa, se adicionaron las concentraciones de MIC y CIF establecidas para láctico y acético a la masa y se evaluó el tiempo de conservación.

5.3.7.1. Fabricación de la Arepa

Las arepas se fabricaron tal como se describió en Materiales y Métodos generales. Los tratamientos fueron:

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- Adición de ácido láctico en concentración final de 357,67 mM. - Adición de ácido acético en concentración final de 41,57 mM

- Adición de mezcla de ácido láctico 56 mM con 30 mM de ácido acético. - Arepas control sin ácidos.

Una vez cocidas, las arepas se enfriaron a temperatura ambiente por 90 min, se empacaron y sellaron en bolsas de polietileno y se almacenaron a 10 ºC y 20 ºC. Durante el almacenamiento se realizaron los recuentos fúngicos para determinar la vida útil.

5.3.7.2 Determinación de la estabilidad de la arepa adicionada de ácidos orgánicos láctico y acético.

Se hicieron las siguientes determinaciones para las arepas.

5.3.7.2.1 Estudio de la resistencia de la arepa adicionada de ácidos láctico y acético a la contaminación natural.

El estudio de los recuentos de hongos filamentosos en la arepa se hizo tal como se describió en materiales y métodos generales. Este ensayo se realizó durante con el fin de evaluar el tiempo para que el producto para obtener el nivel máximo de 103 UFC / g permitido por la Norma Técnica Colombiana NTC 5372 (ICONTEC, 2007). La vida útil se definió como el tiempo en días en que el recuento fúngico alcanza valores de 103 UFC/g.

5.3.7.2.2 Estudio de la resistencia de la arepa adicionada de ácidos láctico y acético a la contaminación artificial.

Con el fin de determinar la resistencia fúngica que daban los ácidos agregados a las arepas, las arepas hechas con las soluciones de ácidos fueron contaminadas superficialmente con A. flavus AFUNL1, según lo descrito en materiales y métodos generales. Los tratamientos fueron los mismos descritos para la resistencia a la contaminación natural y se hizo además un grupo de arepas no contaminado con conidios. Las arepas se empacaron y sellaron en bolsas de

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polietileno, se almacenaron a 10ºC y 20ºC y se observaron diariamente para determinar la aparición visible de los hongos. La resistencia a los hongos dada por los conservantes ácidos se definió como el tiempo (en días) necesarios para hacer visibles los hongos (Gerez, Torino, Rollán Font de Valdez, 2009).

5.3.7.3 Evaluación sensorial de arepas adicionadas con ácidos láctico y acético y mezclas de ambos.

Las arepas fabricadas con ácido acético 41,57 mM, ácido láctico 357,67 mM y la mezcla 56 mM láctico: acético 30 mM fueron evaluados por 22 panelistas no entrenados en el CIDCA. Se presentaron a los evaluadores las arepas en porciones idénticas (10 g) numeradas mediante números de tres dígitos aleatorios. Los panelistas evaluaron apariencia, consistencia, sabor y aceptabilidad global utilizando la siguiente escala: con los puntos (0) "No me gustó nada", (5) "Tampoco me gusta o me disgusta", y (10) "Me gusta mucho "(valores de aceptación). (Auerswald, Schwarz, Kornelson, Krumbein Bruckner, 1999).

5.3.8 Análisis estadístico.

Todos los parámetros de crecimiento se analizaron con el programa SIGMAPLOT® 9.0. Los resultados de tres ensayos independientes se presentan como los valores medios y sus correspondientes desviaciones estándar (SD). Se analizaron diferencias significativas en la cinética de crecimiento mediante el análisis de varianza (ANOVA) empleando un nivel de significación p<0,05. Ello se realizó utilizando el programa STATGRAPHICS Plus 5,1. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

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