Capítulo 1. La hemorragia intracerebral 1.1 El ictus
2.4 Mecanismos moleculares implicados en la toxicidad del r-tPA
A parte de los desajustes en la cascada de coagulación, el r-tPA activa diferentes vías moleculares a nivel tisular que dan lugar a efectos deletéreos no relacionados con su actividad fibrinolítica (Figura 3). Como hemos explicado, este tratamiento tiene una estrecha ventana terapéutica debida a las complicaciones asociadas a éste, siendo una de las más importantes la TH y el daño neuronal. Como se describirá a continuación, durante los últimos años se ha puesto de manifiesto que la aparición de la TH tras el tratamiento trombolítico podría estar causada, en parte, por los efectos no fibrinolíticos que llevan a la activación y reclutamiento de leucocitos y la disrupción de la BHE (Figura 4) (Jickling et al., 2014).
Se han descrito dos tipos de TH según el tiempo de aparición: temprana (si se producen en las primeras 18-24 horas) y tardía (tras las 24 primeras horas). Los mecanismos implicados en la disrupción de la BHE y la consecuente aparición de TH son diferentes en cada caso. Los mecanismos implicados en la TH temprana son principalmente el daño en los capilares
Figura 4 Reorganización de la NVU en respuesta a condiciones neuropatológicas. El cuadro superior muestra la BHE bien
estructurada, mientras que en el cuadro inferior se muestran algunos de los procesos fisiopatológicos asociados a la disrupción de la BHE tras la administración de r-tPA en condiciones isquémicas. Entre ellos, la lesión neuronal, activación de astrocitos, de microglia, y la estimulación de la proliferación endotelial y la migración con la consiguiente interrupción de la expresión de las TJ y una mayor permeabilidad de la BHE, con la extravasación de proteínas plasmáticas y formación de edema. La liberación de metaloproteasas mediante la migración de las células endoteliales y pericitos conduce a la degradación de la de la membrana basal. La secreción de mediadores inflamatorios por parte de astrocitos activados y células endoteliales estimula la expresión de moléculas de adhesión en las células endoteliales y el reclutamiento de células inflamatorias en el cerebro e inflitración de neutrófilos. Especies reactivas del oxígeno y proteasas liberadas por los leucocitos y células perivasculares activados causan estrés oxidativo que contribuye a la disrupción de la BHE.
por las especies reactivas del oxígeno (eROS), la activación e infiltración de leucocitos al cerebro y la liberación de MMPs secretadas por los neutrófilos. En cambio, los implicados en la TH tardía se relacionarían con las MMPs liberadas por diferentes tipos celulares de la unidad neurovascular, la neuroinflamación (microglia activada y infiltración de monocitos que se convertirán en macrófagos) y mecanismos que se activan durante la remodelación vascular (Jickling et al., 2014) (Figura 4).
2.4.1. Disrupción de la BHE por r-tPA
Como se mostrará a continuación, se han estudiado diferentes vías activadas por tPA (endógeno y exógeno) en condiciones isquémicas y que contribuyen al daño neuronal (excitotoxicidad) y a la disrupción de la BHE, la cual se caracteriza por ser una barrera físico- química y enzimática que permite el transporte selectivo de sustancias (Figura 4). Además de la BHE, la lámina basal también previene de la extravasación de compuestos celulares de los capilares y arteriolas al parénquima. Tanto la isquemia cerebral como el r-tPA promueve la expresión y liberación de MMPs por parte de leucocitos activados por la inflamación, así como también por los diferentes tipos celulares de la unidad neurovascular tras el estado de neuroinflamación (Jickling et al., 2014). De hecho, hay evidencias claras entre una elevada concentración de MMP-9 plasmática y una subsecuente TH inducida por el r-tPA en pacientes que han sufrido un ictus isquémico (Castellanos et al., 2003; Castellanos et al., 2007; Montaner et al., 2001, 2003; Ning et al., 2006).En un modelo animal de isquemia cerebral basado en la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) también se ha observado un incremento en la actividad y expresión de MMP9 tanto en plasma como en tejido cerebral dando lugar a la disrupción de la BHE y la degradación de la lámina basal (Tsuji et al., 2005; Yepes et al., 2003) (Figura 4).
Muchos de los efectos tóxicos atribuidos al r-tPA se justifican por su entrada al cerebro a través del receptor LRP1. Un incremento en la transcitosis mediada por la vía tPA-LRP1 a nivel endotelial se ha relacionado con un incremento en la permeabilidad y disrupción de la BHE tanto en condiciones isquémicas como fisiológicas (Yepes et al., 2003; Popavarapu et al., 2007; Benchenane et al., 2005). Algunos autores han propuesto que si durante la acción del r-tPA los efectos de la isquemia se revierten rápido, el r-tPA permanece en el espacio vascular y la BHE permanece intacta. Pero si las condiciones isquémicas se prolongan, y la acción trombolítica es ineficiente, hay un riesgo de que el r-tPA atraviese la BHE vía LRP1 y entre al parénquima encefálico, incrementando la permeabilidad vascular y dañando la unidad neurovascular (Adibhatla y Hatcher, 2008; Yepes et al., 2009), dando lugar a complicaciones hemorrágicas (Jickling et al., 2014).Además, la interacción tPA-LRP1 da lugar
a la activación de la vía NF-ĸB, lo que genera un incremento de la expresión y activación de MMPs (Suzuki et al., 2009) y del estrés oxidativo (Zhang et al., 2007).
2.4.2. Excitotoxicidad
Por otro lado, el r-tPA es capaz de activar el receptor N-Metil-D-Aspartato (rNMDA), receptor de glutamato que es el principal neurotransmisor excitatorio en el cerebro. Se ha observado que a nivel neuronal el tPA puede interaccionar con la subunidad NR1 del receptor NMDA y con su actividad proteolítica incrementa la excitotoxicidad de esta vía (Nicole et al., 2001). Tanto in vivo como in vitro, el tPA incrementa la entrada de calcio en neuronas vía rNMDA, contribuyendo a la neurotoxicidad en neuronas corticales y excitotoxicidad en neuronas del hipocampo (Parcq et al., 2012). Los efectos adversos del tPA dependen de la forma del tPA (su conformación en una o dos cadenas), la dosis el tipo de receptor que active con su actividad proteolítica, y el tipo neuronal donde actúe (Parcq et al., 2012; Chevilley et al., 2015).
2.4.3. Inflamación periférica y neuroinflamación: infiltración de leucocitos
Al igual que se ha explicado en el capítulo 1 tras la hemorragia cerebral, en el ictus isquémico se produce un estado de inflamación. Tanto la isquemia cerebral, tras la administración de r-tPA, como la reperfusión, promueven un estado inflamatorio que se inicia en la microcirculación. Las células endoteliales, los astrocitos y la microglia se activan por la liberación de citoquinas sistémicas (TNF, IL-1, entre otras), que inician una respuesta inflamatoria (Hallenbeck, 1996). Éstas activan la cascada molecular que da lugar a una segunda respuesta inflamatoria más duradera mediada por otras citoquinas como IL-8 o IL- 6, quimioquinas y moléculas de adhesión celular en el endotelio vascular y leucocitos. Estos mediadores inflamatorios producen efectos deletéreos sobre las proteínas ocluyentes (TJ, Tight Junctions) (Huber et al., 2001a; 2001b) incrementando la permeabilidad de la BHE. De nuevo, las MMPs juegan un papel importante tanto en el incremento de la permeabilidad via proteólisis de la lámina basal y TJ, así como en la infiltración de neutrófilos (Rosell et al., 2008) (Figura 4 ).
Por otro lado, el r-tPA puede regular genes relacionados con la respuesta inmune en leucocitos. Se ha observado que el r-tPA incrementa la expresión de moléculas de adhesión endotelial como ICAM2, P-selectinas y E-selectinas en células del sistema inmune (Zhang et al., 1999; Zhang et al., 2008), moléculas de adhesión intercelular (como ICAM2), proteína inhibitoria de unión al DNA (ID2),o actinina (ACTN1) involucrados en la adhesión de células inflamatorias, migración y reclutamiento Jickiling et al., 2010. Por su parte, a nivel
endotelial también se ha descrito un incremento de VAP-1 endotelial en pacientes con TH asociada a r-tPA y de su forma soluble en plasma (Hernandez-Guillamon et al., 2010). Se hipotetiza que el incremento en la expresión de estas moléculas de interacción endotelio- leucocito podría tener un papel relevante en la disrupción de la BHE y podría estar asociado a la aparición de TH debido al r-tPA (Figura 4).
En el caso concreto de los neutrófilos, su activación ocurre en las fases tempranas del ictus isquémico y se ha visto que el r-tPA promueve la activación de la expresión de genes implicados en su migración, reclutamiento y adhesión al endotelio (como por ejemplo el factor estimulante de macrófagos (CSF1, del inglés Colony stimulating factor 1), Annexina y selectinas) (Jickling et al., 2010). El r-tPA también promueve la degranulación de neutrófilos (Cuadrado et al., 2008), liberando enzimas proteolíticas, como MMP9, para facilitar la transmigración de leucocitos a través de la BHE al cerebro, pudiendo contribuir a la aparición de TH (Justicia et. al., 2003; Gidday et al., 2005; Rosell et al., 2006) (Figura 4).
2.5. Biomarcadores de TH
En los últimos años, muchos autores han realizado estudios en busca de biomarcadores plasmáticos para poder mejorar la eficacia del tratamiento trombolítico y pronosticar posibles complicaciones hemorrágicas. Como ya se ha descrito anteriormente, las MMPs juegan un papel importante en la aparición de TH. Por ejemplo, diferentes estudios han determinado que los valores basales de MMP-9 en plasma de pacientes con ictus isquémico son un buen marcador pronóstico de la aparición de la TH tras el tratamiento trombolítico, y se ha sugerido que la determinación de sus niveles plasmáticos podría ser un biomarcador pronóstico antes de la administración del r-tPA (Castellanos et al., 2003; Montaner et al., 2003; Horstmann et al., 2003; Barr et al., 2010). Otros estudios han encontrado asociaciones entre el riesgo de sufrir una TH y los niveles plasmáticos de moléculas implicadas en la cascadad de coagulación/fibrinólisis, como la fibronectina (Castellanos et al., 2004; Castellanos et al., 2007), el fibrinógeno (Trouillas et al., 2004), el inhibidor de fibrinólisis activable por trombina (TAFI) (Ribó et al., 2004), o el inhibidor del plasminógeno tisular (PAI-1) (Ribó et al., 2004); y moléculas relacionadas con la inflamación o infiltración leucocitaria, como la proteína de adhesión vascular (VAP-1) (Hernández-Guillamon et al., 2010), S100B (Foerch et al., 2007), la Proteína C activada (APC) (Mendioroz et al., 2009), o el factor de crecimiento derivado plaquetario (PDGF-CC) (Rodríguez-Gonzalez et al., 2013), el cual regula la permeabilidad y integridad de la BHE tras la administración de r-tPA (Su et al., 2008). Aunque algunos de estos resultados son prometedores, ningún biomarcador se ha llevado a la práctica clínica hasta la fecha.