Mecanismos moleculares de la remodelación del citoesqueleto de actina

La primera fase de formación de un filamento de actina, que consiste en la asociación de dos o tres subunidades de actina unidas a ATP, se denomina nucleación. Una vez formado el núcleo la G-actina (forma monomérica) se une al filamento en función de su concentración. En el estado estacionario la adición de ATP-actina es favorable en el denominado extremo (+). Una vez la

actina se une al filamento el ATP se hidroliza, produciendo ADP + Pi unido al monómero. La

consiguiente liberación del Pi provoca la disociación de ADP-actina en el extremo (-).

Posteriormente se intercambia el nucleótido ADP por ATP para empezar un nuevo ciclo de

polimerización (Figura 1). Aunque la secuencia de aminoácidos de la actina de S. cerevisiae

(Act1) sólo difiere en un 9% a la actina de mamíferos y su estructura es prácticamente idéntica, su actividad bioquímica es ligeramente diferente. Por ejemplo, en la actina de levadura

liberación del Pi es simultánea a la hidrólisis de ATP, por lo que la polimerización de actina de

levadura es más rápida que la de su homólogo en mamíferos. En la Tabla 1 se muestra un

listado con los reguladores de actina de S. cerevisiae, y en la figura 2 se ilustran sus funciones

moleculares más relevantes.

La estabilización del núcleo de actina es realizada por los nucleadores de actina. S. cerevisiae

contiene 2 tipos de nucleadores: las forminas y el complejo Arp2/3, dos tipos de nucleadores altamente conservados en organismos eucariotas. Las forminas catalizan la formación de estructuras de actina lineales, como las fibras de estrés, filopodia, o los cables de actina

polarizados. S. cerevisiae contiene 2 forminas funcionalmente redundantes, Bni1 y Bnr1. El

mecanismo de nucleación y elongación del filamento de actina mediante las forminas se resume en la Figura 4A. Por su parte el complejo Arp2/3, formado por 7 proteínas -Arp2, Arp3 (estas dos proteínas son muy similares a la actina y mimetizan la formación de un dímero de actina), Arpc1 (Arc40 en levadura), Arpc2 (Arc35), Arpc3 (Arc18), Arpc4 (Arc19), y Arpc5 (Arc15)-, se acopla en un filamento preexistente con un ángulo de aproximadamente 70º dando lugar a una estructura de actina ramificada con el complejo Arp2/3 en la junta entre el filamento inicial y el extremo (-) del nuevo filamento (ver mecanismo en la Figura 4B). El complejo Arp2/3 de levadura tiene mayor actividad basal que el de organismos superiores, pero en todos los casos la acción de proteínas activadoras conocidas como NPFs aumenta la formación de nuevos

extremo (+) varios órdenes de magnitud. S. cerevisiae contiene 5 NPFs: Las17, que es el

homólogo de WASP, las miosinas de tipo I Myo3 y Myo5, Pan1, y Abp1. Todos los NPFs contienen una secuencia rica en aminoácidos ácidos (CA) de unión al complejo Arp2/3, pero

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para activarlo Las17 y Myo3/Myo5 (NPFs de tipo I) interaccionan con G-actina a través de su dominio WH2 (que en el caso de las miosinas se ubica en otra molécula, la Vrp1) mientras que Pan1 y Abp1 (NPFs de tipo II) interaccionan con F-actina, que también actúa como activador del complejo Arp2/3. Esta diferencia es significativa puesto que los NPFs de tipo I son mucho más potentes que los de tipo II. En la Figura 6 se muestran los NPFs más representativos, mientras que su función biológica se resume brevemente en la sección 8.1.2. Además de los NPFs, la coronina (Crn1) también regula la actividad del complejo Arp2/3, restringiendo su actividad en los lugares donde abundan los filamentos de reciente creación.

Solo 6 proteínas que unen G-actina están conservadas en todos los organismos eucariotas:

ADF/cofilina (Cof1 en S. cerevisiae, ver más abajo), profilina (Pfy1), Srv2/CAP, twinfilina (Twf1),

verprolina (Vrp1), y WASP/WAVE (Las17). Pfy1 unido a ATP-actina constituye la mayor fuente de monómeros para la polimerización en el extremo (+), e impide la nucleación espontánea y la elongación en el extremo (-). Srv2 facilita el intercambio de nucleótido desde ADP-actina unido a cofilina (ver debajo) a ATP-actina, que se unirá a la Pfy1 para empezar una nueva ronda de polimerización. Twf1 inhibe el intercambio de nucleótido de ADP-actina a ATP-actina y a la vez estimula el desensamblaje del filamento de actina. Vrp1 recluta Las17 a los sitios donde se requiere la formación de un citoesqueleto de actina dinámico, y además activa la función NPA de Myo5 y Myo3 aportando los dominios de unión a G-actina (dominios WH2).

El recubrimiento de los filamentos de actina impide la adicción y disociación de monómeros. Dos tipos de proteínas con función ‘capping’ de extremo (+) se conservan en eucariotas: CP, formado por las subunidades Cap1/Cap2, y Aip1. CP restringe la longitud del filamento y aumenta la motilidad dependiente de actina modificando la arquitectura del entramado de redes de actina. Aip1 se une al extremo (+) de la F-actina fragmentada por la acción de Cof1, impidiendo su elongación y favoreciendo la conversión de oligómeros de actina en G-actina. La rotura y posterior despolimerización de los filamentos de actina es importante para dinamizar la actina filamentosa, ya que proporciona nuevos extremos (+) e incrementa la disponibilidad

de G-actina. En S. cerevisiae esta función la realiza la proteína Cof1, miembro de la familia

ADF/cofilina. Cof1 también inhibe el intercambio de nucleótido de ADP-actina a ATP-actina, por lo que la presencia de Aip1, Srv2 y Pfy1 es necesaria para el reciclaje de los monómeros tras su disociación. Recientemente se ha identificado otro miembro de la familia ADF/cofilina en levadura, Aim7, pero su función se limita a eliminar las ramificaciones de actina producidas por el complejo Arp2/3 y a inhibir la formación de nuevos filamentos.

En S. cerevisiae, la actina se encuentra preferentemente en forma de F-actina, organizado en estructuras especializadas. Estas estructuras pueden contener proteínas que se asocian a lo largo de los filamentos de actina, proteínas que conectan diferentes filamentos de actina entre sí, o proteínas que enlazan los filamentos de actina con otras estructuras celulares. Las tropomiosinas son proteínas conservadas que se asocian a lo largo de los filamentos de actina, principalmente los nucleados por las forminas ya que no contienen ramificaciones que

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de filamentos de actina para formar estructuras complejas se realiza mediante proteínas que

contienen varios dominios de unión a actina o bien dominios de oligomerización. S. cerevisiae

contiene 4 proteínas que realizan esta función, 3 de ellas conservadas durante la evolución: la

fimbrina Sac6, Scp1, y la IQGAP Igq1. Abp140, por el contrario, parece existir únicamente en S.

cerevisiae. La asociación entre los filamentos de actina y estructuras celulares membranosas se realiza mediante proteínas que interaccionan con lípidos específicos o que están unidas covalentemente a lípidos, proteínas integrales de membrana, o proteínas que interaccionan con

membranas a través de proteínas adaptadoras. En S. cerevisiae hay en concreto 2 tipos de

proteínas de unión a actina que interaccionan directamente con membranas: las miosinas no

convencionales y el homólogo de Hip1R Sla2. Sla2 interacciona con PIP2 mediante su región N-

terminal y a actina filamentosa mediante la región C-terminal.

Las miosinas son motores moleculares que se mueven a lo largo de los filamentos de actina y consisten en una o dos cadenas pesadas unidas a un número variable de cadenas ligeras. Existen alrededor de 25 tipos de miosinas; algunos de ellos se expresan en todos los organismos mientras que otros están presentes sólo en determinadas especies. La cadena pesada de las miosinas está constituida por la cabeza, que contiene la región motora, seguida de una cola responsable de la dimerización de la miosina o de la unión a su carga. Entre la cabeza y la cola se encuentra una región ‘cuello’ de unión a las cadenas ligeras de la miosina a través de sus motivos IQ. La región motora usa la energía química del ATP ara producir fuerza mecánica en un proceso denominado ciclo ATPasa de actomiosina, que se resume en la Figura 14. El cuello sirve como palanca, convirtiendo los pequeños cambios conformacionales de la región motora en importantes movimientos en la cola de la miosina. La cola de las miosinas difiere considerablemente entre los diferentes tipos de miosinas, y define la localización y

función de dichas proteínas. S. cerevisiae contiene 5 miosinas: la miosina de tipo II Myo1, las

miosinas de tipo V Myo2 y Myo4, y las miosinas de tipo I Myo3 y Myo5. Además, expresa 3 cadenas ligeras: la calmodulina Cmd1, y las proteínas Mlc1 y Mlc2. La organización funcional de

las cadenas pesadas y ligeras de las miosinas de S. cerevisiae se representa en la Figura 15.

 La miosina de tipo II de mamíferos fue las primera miosina identificada, ya que es la

proteína más abundante en el músculo esquelético. Además de formar parte de células musculares, las miosinas de tipo II no musculares funcionan en una gran variedad de procesos como la citoquinesis, la adhesión o la migración muscular, entre otros. Están constituidas por 2 cadenas pesadas que a su vez unen 2 cadenas ligeras, Mlc1 y Mlc2 en

el caso de S. cerevisiae. El dominio C-terminal interviene en la dimerización entre

cadenas pesadas. Myo1 participa en la separación entre célula madre y célula hija durante la citoquinesis.

 Las miosinas de tipo V transportan cargas dentro de la célula ‘caminando’ sobre los

filamentos de actina. También están constituidas por 2 cadenas pesadas, pero cada una tiene 6 sitios de unión a cadenas ligeras. Tras la región de dimerización poseen un dominio globular (GTD) implicado en la unión y transporte de la carga. Las miosinas-V de S. cerevisiae Myo2 y Myo4 transportan diferentes cargas: Myo2 transporta vesículas,

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orgánulos, y microtúbulos, mientras que Myo4 transporta retículo endoplasmático cortical y complejos de proteína-mRNA. No está claro si Myo4 también forma dímeros.

 Las miosinas de tipo I son monoméricas, y sus funciones varían entre diferentes tipos

celulares. Poseen un número variable de motivos IQ, que en el caso de Myo3 y Myo5 son 2 regiones de unión a Cmd1. Pueden contener una versión de la cola C-terminal corta o larga. Ambas contienen una región rica en aminoácidos básicos que facilita la unión de la miosina a membranas (TH1). Además de la región TH1, la versión larga

incluye una extensión C-terminal (Cext) que contiene una región de unión a F-actina

(TH2) y un dominio SH3 que media la interacción con motivos ricos en prolinas. Algunas miosinas de cola larga interaccionan con el complejo Arp2/3 mediante dos mecanismos alternativos: las miosinas de levadura contienen la región rica en aminoácidos ácidos involucrada en la activación del Arp2/3 (CA), mientras que algunas miosinas de protozoos reclutan al complejo indirectamente a través de la proteína CARMIL. Las

miosinas de tipo I de S. cerevisiae Myo3 y Myo5 tienen la estructura típica de la

miosinas de cola larga. Tienen una función esencial en la captación endocítica, y tanto su actividad motora como de activación del complejo Arp2/3 son imprescindibles para esta función (ver más abajo). La actividad motora está regulada por una fosforilación/defosforilación de una serina conservada situada en la región de unión de unión al filamento de actina (sitio TEDS). La actividad NPA se regula mediante una

interacción autoinhibitoria entre el TH1 y el Cext estabilizada por la Cmd1.