Ph.D. Escuela de Biociencias, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, 2
Ph.D., D.Sc. Escuela de Física, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia sede Medellín.
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Resumen. El estudio de las toxinas de la bacteria Gram positiva Bacillus thuringiensis subespecie medellin
indica que su sitio de acción es en la parte posterior del intestino medio. Igualmente el clonaje y secuenciación de los genes de estas toxinas ha permitido conocer la estructura tridimensional de al menos la toxina Cry11Bb. La evaluación de péptidos derivados de regiones del dominio I de ésta toxina indica que al menos dos péptidos tienen actividad insecticida, antimicrobiana y antitumoral. El desarrollo y aplicación de herramientas computacionales se convierte en un instrumento nuevo para el estudio de las toxinas Cry y de cualquier proteína, con el objeto de analizar sus secuencias en la búsqueda de nuevas sustancias bioactivas de utilidad en salud pública y en agricultura.
Palabras clave: Bacillus thuringiensis, toxinas Cry, péptidos insecticidas, péptidos antimicrobianos.
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria gram positiva, aeróbica, esporulada, que produce cristales paraesporales constituidos de proteínas sintetizadas al momento de la formación de esporas. Esta bacteria ha sido usada para el desarrollo de biopesticidas desde 1940 para el control de insectos plaga en agricultura y más recientemente para el control de dípteros vectores de enfermedades. Sus cristales paraesporales contienen diferentes tipos de proteínas, algunas de las cuales son tóxicas para insectos cuando son ingeridas. Los insectos que se ven afectados por estas proteínas tóxicas pertenecen principalmente a los órdenes Lepidoptera, Diptera y Coleoptera. Aunque existen algunos reportes de actividad contra otros grupos de insectos como Hymenoptera y Homoptera y también se ha reportado actividad contra nematodos, ácaros y algunas líneas tumorales.
A la fecha se han descrito 72 tipos de toxinas Cry producidas por cepas de Bt aisladas de prácticamente todo el mundo. Esta información se encuentra en la base de datos del profesor Neil Crickmore de la Universidad de Sussex en Inglaterra (http://www.lifesci.sussex.ac.uk /home/Neil_Crickmore/Bt/). También se puede consultar la especificidad de cada una las toxinas de Bt en la base de datos, Natural Resources Canada (http://www.glfc forestry.ca/bacillus/).
Se conoce la estructura tridimensional de siete diferentes toxinas deducidas por cristalografía de rayos X (Cry1Aa, Cry2Aa, Cry3Aa, Cry3Ba, Cry4Aa, Cry4Ba y Cry8Ea) y de otras cuantas deducidas por modelamiento homólogo. En todas ellas se reconocen 3 dominios; el dominio I está conformado por un
barril de 7 hélices α y está implicado en la inserción en la membrana, oligomerización de la toxina y en la formación de poros. El dominio II es un prisma β, mientras que el III está formado por un sándwich de dos
hojas β antiparalelas. Los dominios II y III están implicados en la especificidad mediada por interacciones
especificas con varias proteínas del epitelio intestinal de los insectos susceptibles (Bravo et al., 2007). La estructura tridimensional entre las diferentes toxinas de la familia Cry es conservada, lo que sugiere que tal
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vez el mecanismo de acción también lo sea, a pesar de entre ellas haya una baja similaridad a nivel de secuencia de aminoácidos.
El mecanismo general de acción para las toxinas Cry incluye los siguientes eventos, ingestión, solubilización de los cristales que contienen las protoxinas en el medio alcalino y reductor del intestino medio del insecto, activación de la toxina por proteólisis, reconocimiento y unión a receptores específicos,
seguido por la inserción de las hélices α 4 y 5 del dominio I en la membrana del epitelio intestinal,
oligomerización y la formación de poros que conduce a la muerte celular por desequilibrio osmótico (Schnepf et al. 1998).
Otro mecanismo de acción se ha sugerido recientemente para las toxinas Cry de Bt; por ejemplo, Zhang et al., (2006) han propuesto que la toxina Cry1Ab tras la unión al receptor de cadherina, provoca la
estimulación de la subunidad α de la proteína G y de la adenilato ciclasa en células transfectadas de
Trichoplusia ni que expresan el receptor de cadherina, BT-R1, que a su vez estimula la producción de altos niveles de AMPc y la activación de la proteína quinasa A, situación que desencadena la muerte celular después de la aparición de protuberancias en la membrana celular.
Las subespecies de Bt, israelensis, jegathesan y medellín son altamente tóxicas para las diferentes especies de mosquitos de los géneros Aedes, Anopheles y Culex. Aunque varios receptores han sido identificados para las toxinas Cry11Aa y Cry11Ba en larvas de mosquitos, que incluyen cadherina (Chen et al. 2009), aminopeptidasa N (Chen et al. 2009) y fosfatasa alcalina (Fernández et al. 2009); Leetacheva et al. (2006) y Puntheeranurak et al. (2004) han demostrado que fragmentos de dominio I, específicamente las horquillas α4-α5 y α1-α5, de la toxina Cry4B, permeabilizan liposomas unilamelares e inducen la formación de poros en bicapas lipídicas planas; y recientemente Rodríguez-Almazan et al. (2012) han demostrado que al menos la toxina Cry4Ba, no requiere la unión a un receptor para formar oligómeros, y así causar toxicidad en larvas de Ae. aegypti.
Bacillus thuringiensis subespecie medellin
B. thuringiensis subespecie medellin (Btm) fue reportada en Colombia (Orduz et al. 1992) y produce toxinas activas contra larvas de mosquito como Ae. aegypti, An. albimanus y Cx. quinquefasciatus, que son vectores de importantes enfermedades para los humanos. Las proteínas contenidas en los cristales paraesporales de Btm fueron descritas inicialmente por Orduz et al. (1994). Esta bacteria produce las toxinas Cry11Bb (Orduz et al., 1998), Cry29A, Cry30A (Juárez-Perez et al., 2003) y Cyt1Ab1 (Thiery et al., 1998).
Otros estudios indican que la protoxina Cry11Bb se activa, in vivo e in vitro, por procesamiento proteolítico a una toxina de 65 kDa compuesta de 2 fragmentos de 30 y 35 kDa. Este procesamiento genera un fragmento de 56 aminoácidos del extremo N terminal cuando la toxina Cry11Bb se trata con tripsina y de 60 aminoácidos cuando se trata con extracto de proteasas de intestino de Cx. quinquefasciatus (Segura et al., 2001). Igualmente en el 2001, Gutierrez et al. construyeron un modelo tridimensional teórico por homología computacional de la toxina Cr11Bb de Btm, en donde se observan los dominios I, II y III característicos de las toxinas Cry deducidos por cristalografía de rayos X. En el 2004, Ruiz et al. determinaron que el sitio de acción de la toxina Cry11Bb era el intestino medio posterior de las larvas de mosquito.
Posteriormente y basados en esta información, diseñamos péptidos que en la mayoría de los casos correspondían a cada una de las 7 hélices α del dominio I. Estos péptidos fueron ensayados en mitocondrias
de hígado de rata y se encontró que algunos de ellos, especialmente el BTM-P1, causan poros en la membrana mitocondrial, produciendo hinchamiento (Lemeshko et al., 2005). Así mismo demostramos que
este péptido tiene propiedades antimicrobianas a una concentración de 7.1 µM, tanto en bacterias Gram positivas como Gram negativas (Lemeshko et al., 2006), y que su estructura tridimensional obtenida por resonancia magnética nuclear era de tipo αhelicoidal (Segura et al. 2007).
Posteriormente hemos demostrado que éste péptido policatiónico, anfipático de 26 aminoácidos (BTM-P1) mata larvas de mosquito en concentraciones de 5 y 10 µM, lo cual se constituye en el primer reporte que un fragmento tan pequeño, derivado de una toxina Cry, sea tóxico para larvas de mosquito. Igualmente demostramos que la atracción eléctrica es la principal fuerza que atrae el péptido a las membranas del intestino medio de larvas de mosquito y que no se necesita la unión a un receptor (Lemeshko y Orduz 2013a).
De igual manera hemos desarrollado un nuevo péptido de 33 aminoácidos (BTM-P4) igualmente policatiónico y anfipático, que es activo no solamente contra bacterias, sino que además es activo contra hongos filamentosos y levaduras. Igualmente tiene actividad contra larvas de mosquito y contra algunas líneas tumorales (Lemeshko y Orduz 2013b).
Herramientas bioinformáticas para la búsqueda de nuevos péptidos en toxinas Cry y en otras proteínas.
La búsqueda de péptidos bioactivos en organismos es un ejercicio altamente demandante de tiempo y dinero. Por ésta razón algunos grupos de investigación han desarrollado herramientas bioinformáticas con el propósito de hacer el trabajo de bioprospección menos costoso y más eficiente. Algunos se encuentran disponibles en la red (http://bioware.ucd.ie/~compass/ biowareweb/), mientras que otros no están disponibles para el público (Amaral et al. 2012). Este año, nuestro grupo de investigación desarrolló un algoritmo en Java que permite analizar cualquier secuencia de proteína y seleccionar candidatos de péptidos bioactivos (Betancur et al. 2013), (Figura 1).
Figura 1. Portada del programa ProteinCheck 1.0.
El algoritmo permite seleccionar la longitud del péptido, así como su carga neta y su hidrofobicidad. Para validar el algoritmo, analizamos las proteínas Cry11Bb, Histona 2A y Lactoferrina de donde provienen los péptidos antimicrobianos BTM-P1 (Lemeshko et al. 2006), Buforina II (Cho et al. 2009) y Lactoferricina
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(Gifford et al. 2005). En todos los casos, el algoritmo encontró cada uno de estos péptidos y además de otros posibles candidatos.
Agradecimientos
Los resultados aquí presentados han sido obtenidos en trabajos realizados con proyectos financiados por Colciencias y por la Universidad Nacional de Colombia.
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