METODO SEGUIDO durante el proceso de selección de secuencias con

potencialidad para adquirir la estructura en Z. El ADN procedente de embriones de Drosophila hydei se digirió con una enzima de restricción. Se insertó luego en un plásmido. Tras ligar los fragmen- tos, el ADN resultante se introdujo en la bacteria Escherichia coli. Después de purificar el ADN de los clones así obtenidos, se incubó en presencia de anticuerpos específicos contra la es- tructura Z; se pasó luego el conjunto a través de un filtro de nitrocelulosa. Los plásmidos libres (sin unirse a los anticuerpos) atraviesan la membrana; quedan retenidos en su malla los que se han unido a los anticuerpos. Los plásmidos retenidos en la membrana se eluyeron forzando la reversión de las secuencias en Z a la configuración B, mediante tratamiento con bromuro de etidio. El ADN liberado se introdujo de nuevo en E. coli, generando así una colección de clones que contienen secuencias del genoma de D. hydei con capacidad para adoptar la estructura Z. El análisis de uno de los plásmidos seleccionados, denominado pF17, mostró la existencia de la secuencia 5′ GCGCGC

3′ que actúa como zona de nucleación

de la estructura Z-ADN. También se indica la posición relativa de la se- cuencia 5′ TGCACTTG 3′, similar a la

mitad derecha de la secuencia descrita como dominio de unión del receptor de ecdisona.

de la molécula, almacenada en el superenrollamiento, la capacitaría para adquirir la conformación Z-ADN y mantener estable dicha estructura. El Z-ADN puede acumular parte de la energía potencial de torsión favore- ciendo el relajamiento global de la molécula de ADN. Este hecho podría

a priori explicar la existencia de la conformación Z en sistemas celulares. ¿Qué función fisiológica asignarle?

La molécula de ADN ocupa el lugar central en la replicación y en la transcripción. En la replicación se duplica el material genético antes de la división celular; en la transcripción se copia una de las cadenas del ADN en una molécula de ácido ribonu- cleico (ARN) por medio de la ARN polimerasa. Ambos procesos celulares determinan el estado energético glo- bal de la molécula y, por tanto, su grado de superenrollamiento. Uno y otro proceso requieren, para su eje- cución, que las cadenas se separen, lo que introduce tensiones dentro de la molécula de ADN.

El avance de la ARN polimerasa a lo largo de la hélice durante la transcripción modifica la topología de la hélice del ADN. Aparecen, en efecto, superenrollamientos negativos en la zona 5′ inmediata a la posición ocupada por la enzima y un superen- rollamiento positivo en la región 3′ de la vecindad de la ARN polimerasa. A esa doble generación de superenro- llamientos se le denomina “dominio doble de superenrollamiento local”. Su relación con la inducción de la estructura Z la demostró, entre otros, Robert D. Wells. Su trabajo consistió en comprobar si las secuencias sin- téticas de nucleótidos, homólogas de las que inducían in vivo la estructura Z, conformaban dicha configuración cuando se introducían, insertas en un vector, en el interior celular.

De acuerdo con los resultados del equipo de Wells, había un segmento, (GpC)₆, que adquiría la conformación Z-ADN si se insertaba en posición 5′ respecto al origen de transcripción del gen tet del plásmido pBR322 introdu- cido en E. coli. Pero no se adquiría la configuración Z si se colocaba en posición 3′ del gen o del avance de la ARN polimerasa.

Peter Droge y Alfred Nordheim demostraron que, durante el avance de la ARN polimerasa T7, se ori- ginaba en el ADN un superenrolla- miento negativo en zonas próximas a la enzima. Otros muchos traba- jos posteriores corroborarían que, lo mismo en el cromosoma bacteriano que en plásmidos, ciertas zonas del ADN adquirían la conformación Z.

¿Se daría también esa configuración entre los eucariotas, sistemas más complejos?

Los cromosomas de eucariotas cons- tan de largas hélices de ADN, cuyos nucleótidos se cuentan por cientos de millones. Mas, a diferencia de los cromosomas bacterianos, no se encuentran unidos covalentemente en sus extremos. Esta discrepancia es- tructural plantea la incógnita de la existencia de la estructura Z en los cromosomas eucariotas. Para resolver la situación, los investigadores se han apoyado en la excelente capacidad antigénica del Z-ADN. David Stollar, de la Universidad de Tuffs, encontró que moléculas de ADN con estructura Z inducían la formación de altos títu- los de anticuerpos al introducirlas en animales de experimentación. Gracias a ese descubrimiento, disponemos ya de anticuerpos monoclonales y poli- clonales altamente específicos capaces de unirse a la estructura Z.

M

ediante técnicas de inmunofluo- rescencia indirecta, que sacan a primer plano la unión de anticuerpos en los cromosomas, se encontró que los anticuerpos anti-Z se engarzaban en los cromosomas politénicos, gigan- tes, de Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta. Los cromosomas del díptero, con su enorme tamaño y estructura singular, constituyen un material de trabajo excelente. En estos cromosomas podemos percibir zonas de elevada transcripción (interbandas) y zonas de mayor condensación del ADN (bandas).

En su trabajo sobre la unión de anticuerpos anti-Z, el grupo de Donna J. Arndt-Jovin llegó a la conclusión de que las secuencias de Z-ADN se localizaban en las bandas (regiones condensadas) de los cromosomas. Por contra, el equipo de MariLu Pardue halló, según alegó, las secuencias Z-ADN en las interbandas.

¿A qué se debían esas discrepan- cias? Los resultados a que nosotros llegamos en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de Madrid pusieron de manifiesto que la dispar localización de los anticuerpos anti-Z en bandas o interbandas tenía que ver con las técnicas experimentales utilizadas en la preparación de los cromosomas. En éstos había fuerzas de torsión que, tras liberarse por efecto del tratamiento en la prepa- ración de muestras, se manifestaban en la aparición de estructuras Z en la secuencia de ADN.

Nuestros resultados indicaban, ade- más, que podía revertirse, por vía

62 INVESTIGACIÓN Y CIENCIA, abril, 1997 experimental, el tránsito de estructura

B a Z en el mismo segmento cromo- sómico con sólo variar las condiciones del ensayo. Ello no era obstáculo para que encontráramos, trabajando con cromosomas en condiciones na- tivas, que había regiones portadoras de secuencias estructuradas en Z, regiones que mostraban una elevada actividad transcripcional.

Observamos que no había Z-ADN ni actividad transcripcional apreciable en las zonas de bandas. La mayor parte del Z-ADN y la síntesis de ARN parecían localizarse en las interbandas. ¿Estaba la presencia de Z-ADN acaso ligada a la síntesis de ARN? Las hipótesis de partida no eran del todo exactas. No existe Z-ADN en todas las interbandas de los cromosomas politénicos, pese a que en ellas se detecte transcripción.

Para analizar con mayor profundi- dad la relación entre actividad trans-

cripcional y formación de estructura Z-ADN en los cromosomas de Dro-

sophila, centramos nuestra atención en subregiones cuya activación se regula durante el desarrollo de la larva o cuya actividad puede re- gularse mediante el control de las condiciones experimentales. Cuando se provoca que esas regiones proce- dan a transcribirse, se observa un cambio morfológico caracterizado por un relajamiento (“desconden- sación”) de la cromatina: aparecen los abultamientos (“puffs”) en los cromosomas. Así, cuando a las lar- vas de Drosophila se les somete a una temperatura de 37o_{C durante} una hora, en lugar de exponerlas a las condiciones normales de 25o_C, se forman en los cromosomas una serie de “puffs” de choque térmico; allí empieza la transcripción activa de genes que cifran proteínas que protegen del calor a las células.

Quería ello decir que, si la transcrip- ción se hallara vinculada a la estruc- tura Z del ADN, detectaríamos esta configuración nucleotídica en tales subregiones. Pero el análisis mediante anticuerpos anti-Z-ADN no descubrió formas Z-ADN en las subregiones inducidas por calor. Sí aparecían, por contra, zonas de Z-ADN en los “puffs” inducidos por incubación de las glándulas salivales en presencia de ecdisona. En estas regiones se localizan los genes cuyos productos de expresión son necesarios para des- encadenar los cambios morfológicos que conducen a la formación del pupario y de la mosca adulta.

E

n una línea de investigación si- milar ha trabajado el grupo de Burghardt Wittig y Tomislav Dorbic de la Universidad Libre de Berlín, en colaboración con Alexander Rich del Instituto de Tecnología de Massa- chusetts. Partieron de núcleos trans- cripcionalmente activos embebidos en agarosa; en ellos analizaban la incor- poración específica de anticuerpos anti- Z-ADN. A bajas concentraciones de anticuerpo, vieron que la incorporación específica aumentaba con la cantidad de anticuerpo aplicado al tratamiento de los núcleos hasta alcanzarse un nivel donde ya no se producía una incorporación ulterior del anticuerpo, sino que se estabilizaba en una meseta: todos los fragmentos cromosómicos en estructura Z que había en los cromosomas antes de la adición del anticuerpo se saturaban de éste. A ma- yores concentraciones, se alcanzaba un mayor nivel de incorporación, porque el anticuerpo inducía por sí mismo la conformación Z-ADN en nuevas regiones cromosómicas donde esta es- tructura no existía con anterioridad. Así determinaron los niveles nativos de Z-ADN presentes en los núcleos antes de la inducción y se cuantificó el efecto inductor de los anticuerpos sobre la transición estructural.

Pero Wittig, Dorbic y Rich fue- ron más lejos. Demostraron que los inhibidores de las topoisomerasas, enzimas que se encargan de relajar las tensiones de torsión acumuladas en el ADN, aumentaban la cantidad de estructura Z preexistente en el núcleo celular, por la sencilla razón de que había más energía disponi- ble para realizar la transición a la estructura Z.

En nuestro laboratorio nos propusi- mos entonces aislar y caracterizar las secuencias capacitadas para adquirir la estructura en Z del ADN cromo- sómico. Proyectamos la investigación basándonos en dos características ya conocidas. Primera: los plásmidos con superenrollamiento negativo estabili- zan el ADN en forma Z. Segunda: los anticuerpos anti-Z se traban vi- gorosamente a las hélices de Z-ADN. Creamos una colección de plásmidos a los que se les había unido fragmentos cortos, unos 300 pares de nucleóti- dos, de cromosomas de Drosophila. Desarrollamos —hicimos crecer— los plásmidos en Escherichia coli, donde adquirían superenrollamiento nega- tivo. Los plásmidos superenrollados negativamente se mezclaron con an- ticuerpos específicos anti-Z.

La mezcla se filtró por unas mem- branas de nitrocelulosa, que retenían sólo los plásmidos unidos a los an-

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