Metodología

3.3.1. Formulación de las dietas

Se formularon 5 dietas isoproteicas e isolipídicas para contener 42% de proteína cruda y 12% de lípidos crudos y se incrementó el porcentaje de lisina en dieta utilizando lisina cristalina, lo que resultó en contenidos de: 1.60%, 1.77%, 2.20%, 2.58% y 2.78% del peso seco de la dieta (i.e., dietas nombradas L1.6, L1.7, L2.2, L2.5 y L2.8 respectivamente, Tabla 2).

Se utilizaron aminoácidos ácidos cristalinos libres (EVONIK, UK) para lograr el nivel deseado de lisina en las dietas y además de adicionar metionina, treonina y valina en una proporción 1:1:1 para proveer el nivel mínimo requerido en dieta con base al requerimiento de la corvina roja (Scienops

ocellatus) para no comprometer el crecimiento debido a un bajo nivel de estos aminoácidos ácidos con

Tabla 2. Formulación (g/100 g) y composición proximal (%) de las dietas experimentales. L1.6 = lisina 1.60%, L1.7 =

lisina 1.77%, L2.2 = lisina 2.20%, L2.5 = lisina 2.58% y L2.8 = lisina 2.78%.

Dietas

Ingredientes L1.6 L1.7 L2.2 L2.5 L2.8

Harina de Pescado (sardina) 10 10 10 10 10

Subproducto ave 12 12 12 12 12

Gluten trigo 25 25 25 25 25

Harina trigo 15 15 15 15 15

Almidón gelatinizado 15.97 15.67 15.37 15.07 14.77

Aceite pescado 9 9 9 9 9

Vitaminas y minerales mix 5 5 5 5 5

Vitamina C 1 1 1 1 1 Lisina 0 0.3 0.6 0.9 1.2 Mezcla de aminoácidos 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 Taurina 1 1 1 1 1 Benzoato de sodio 0.23 0.23 0.23 0.23 0.23 Cloruro colina 0.09 0.09 0.09 0.09 0.09 Butilhidroxitolueno 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 Composición proximal Proteína cruda (%) 42.8 42.8 42.2 43.4 42.9 Lípido crudo (%) 11.3 12.3 12.5 12.0 11.5 Ceniza (%) 7.6 7.9 8.1 8.2 8.3

Extracto libre nitrógeno + fibra

(%) 38.1 36.8 37.1 36.3 37.2

Tabla 3. Composición total de aminoácidos de las dietas experimentales (g/100 g)*. L1.6 = lisina 1.60%, L1.7 = lisina

1.77%, L2.2 = lisina 2.20%, L2.5 = lisina 2.58% y L2.8 = lisina 2.78%.

Dietas L1.6 L1.7 L2.2 L2.5 L2.8 Proteína cruda (%) 42.8 42.8 42.2 43.4 42.9 Aminoácidos esenciales Lisina 16.0 17.7 22.0 25.1 27.8 Metionina 14.4 15.6 15.4 14.0 13.2 Arginina 14.8 14.2 14.0 14.4 14.8 Leucina 23.7 22.6 22.2 26.2 22.8 Isoleucina 13.1 12.7 12.5 12.8 12.8 Histidina 4.70 4.60 5.80 6.00 5.20 Treonina 17.7 16.5 14.8 17.3 16.5 Fenilalanina 14.4 14.0 13.8 16.2 14.2 Valina 29.4 28.8 26.1 26.7 26.0 Triptófano ND2 _{ND ND ND ND} Aminoácidos no esenciales Aspartato + Asparagina 18.0 17.0 16.7 17.0 17.0 Glutamato + Glutamina 108.5 104.9 103.3 106.6 107.4 Serina 7.7 6.1 5.6 8.9 7.8 Glicina 18.4 17.4 18.3 18.1 18.5 Alanina 14.4 13.6 13.7 13.7 14.0 Tirosina 6.7 6.4 5.9 5.7 7.0 Cisteína 2.2 2.9 1.6 2.3 2.3 Prolina 25.5 25.7 24.3 23.5 24.5

3.3.2. Elaboración de las dietas

Las dietas fueron elaboradas en el laboratorio de alimentos del Instituto de Investigaciones Oceanológicas (IIO) en la Universidad Autónoma de Baja California (UABC). Los ingredientes fueron molidos (i.e., 0.5 mm) y mezclados utilizando una moledora comercial con capacidad de 20 kg (Robot- Coupe, USA, model R10) de acuerdo al siguiente protocolo: los macro ingredientes fueron mezclados durante 5 minutos, seguido de la mezcla de los micro ingredientes por 5 minutos adicionales para después agregar el aceite de pescado y se mezclar por 5 minutos. El almidón previamente gelatinizado y se agregó y mezcló durante 3 minutos y por último se agregó agua y se mezcló durante 2 minutos hasta alcanzar la consistencia deseada. La masa obtenida se pasó por un moledor de carne (model M32-5, Tor. Rey, México) con un dado con orificios de 1/16 de diámetro para moldear los pellets. Los pellets fueron secados usando un horno de aire forzado de 10 pies cúbicos (VWR 1600 HAFO series, USA) durante 24 horas, una vez que las dietas estuvieran secas se colocaron en bolsas de plástico selladas y se almacenaron a 4 °C hasta su utilización.

3.3.3. Condiciones experimentales

Se obtuvieron larvas de totoaba que fueron donadas por el Centro Reproductor de Especies Marinas del Estado de Sonora (CREMES), se transportaron por aire desde Hermosillo, Sonora a Tijuana, Baja California. A su llegada se transportaron vía terrestre al Laboratorio de Cultivos de Peces Marinos (LCPM) en el departamento de Acuicultura en CICESE. Las larvas fueron cultivadas en el LCPM hasta que alcanzaron el estadio juvenil. Se distribuyeron 150 juveniles de totoaba (peso inicial 38.9 ± 9.2) aleatoriamente en 15 tanques (n = 10 peces por tanque). Cada tratamiento fue evaluado por triplicado. Los peces fueron alimentados a mano con las dietas experimentales a saciedad aparente 3 veces al día cada 4 horas aproximadamente durante 84 días. La unidad experimental consistió en 15 tanques de 250 litros de fibra de vidrio con fondo azul adaptados a un sistema de recirculación de agua de mar compuesto por un biofiltro de micro cuentas plásticas con capacidad de 3 pies cúbicos (PolyGeyser Model DF #, USA) una lámpara de luz ultra violeta (Model QL – 25, Pentairaquatics, USA) y bomba de agua (Wave II 2 speed pump ¾ hp, USA). La temperatura del agua del sistema se mantuvo a 25 °C con una bomba de calor (Aqualogic model 2TWB0018A1000AB, USA). Los niveles de amonio, nitritos y nitratos del agua del sistema se midieron cada semana con un kit para acuario (APA®_{; USA). La temperatura del agua y el oxígeno}

3.3.4. Colección de muestras

Al inicio del experimento se colectaron 3 peces como muestra inicial. Al final del experimento se colectaron 3 peces por tanque y se sacrificaron por sobredosis (200 mg/l) de tricaina (MS-222) de acuerdo con el comité de bioética de la institución. Después, los peces se congelaron a -20 °C para su posterior análisis de composición proximal del inicio del bioensayo y del final del bioensayo. El crecimiento de los peces se evaluó utilizando un ictiómetro (Aquatic Eco – Sistems, Inc. FL, USA) para su longitud (cm) y pesándolos con una balanza (Model AND SK – 2000WP) para estimar el peso inicial (PI) y final (PF). EL consumo de alimento se estimó diariamente tomando el peso inicial del recipiente de alimento del tanque antes de alimentar y posteriormente se restó el alimento después de haber alimentado, la diferencia de pesos (g) se tomó como alimento no consumido. En el caso de que hubiera remanentes de alimento no consumido en el fondo del tanque, este se recuperó por medio de un sifón, se secó en una mufla a 60 °C durante 24 horas, se obtuvo su peso (g) y se restó de la cuantificación del alimento consumido para ajustar el valor del alimento consumido (g). A su vez, para la evaluación del coeficiente de digestibilidad se colectaron heces del fondo del tanque con un sifón de vidrio de 40 cm de largo y 2 mm de ancho, inmediatamente después de que los peces liberaron heces (aproximadamente 45 minutos después de ofrecer el alimento) para evitar posible lixiviación (Figura 10). Las muestras colectadas se secaron a 60 °C utilizando una mufla por 24 horas, después se almacenaron a -4 °C en tubos (capacidad de 50 ml) de fondo cónico de polipropileno para su análisis posterior.

Figura 10. Colección de material fecal para la evaluación del coeficiente de digestibilidad aparente. (A) tamiz de 0.2

micras para la colección de las heces por medio de un sifón. (B) lavado del material fecal con agua destilada. (C) deposición del material fecal en navecilla de aluminio para su secado.

3.3.5. Cálculos para medir el desempeño de los juveniles

Los índices de desempeño de los organismos y las dietas se estimaron utilizando las siguientes fórmulas: Ganancia en peso (G) = peso final (g) – peso inicial (g) (1) Ganancia en peso% (GP%) = [(peso final (g) – peso inicial (g)) / peso inicial (g)] x 100 (2) Coeficiente de crecimiento térmico (CCT) = 1000 x [(peso final)1/3 – (peso inicial)1/3] x (°C días). (3) Supervivencia (S) = número de peces restante en cada grupo en día 82 /

número de peces inicial) x 100 (4) Consumo de alimento (CA) = peso (g) total de alimento consumido / número de peces tota (5) Tasa de conversión alimenticia (TCA) = alimento consumido / peso ganado (g) (6) Tasa de eficiencia proteica (TEP) = [peso final (g) – peso inicial (g)] /

peso de la proteína consumida (g) (7) Valor productivo de la proteína (VPP) = proteína retenida (g) / peso proteína consumida (g) (8)

3.3.6. Composición proximal

La evaluación de la composición proximal de las dietas y de los peces (al inicio y al final del experimento) se realizó utilizando métodos bien establecidos. La proteína cruda se determinó por el método de micro-Kjeldahl, donde el total de nitrógeno determinado se multiplico por un factor de 6.5 (de acuerdo a lo establecido para ingredientes de animales por AOAC, 2005). Los lípidos crudos se cuantificaron por extracto etéreo utilizando éter de petróleo por medio de un extractor Soxhlet (AOAC, 1990). La estimación de las cenizas fue mediante incineración de la muestra por medio de una mufla manteniendo una temperatura de 550 °C durante 8 horas. La estimación del extracto libre de nitrógeno + fibra fue calculada substrayendo del 100% el acumulado en porcentaje de la proteína, los lípidos y la ceniza (AOAC, 1990).

3.3.7. Análisis de aminoácidos ácidos

El perfil de aminoácidos de las dietas y de la heces se cuantificaron por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC, Agilent technology, 1260 series, Tokyo, Japan) de acuerdo al protocolo descrito por Schuster et al. (1988). Se utilizaron 20 miligramos de cada muestra fueron hidrolizados con una solución de ácido clorhídrico 6N (volumen/volumen) con fenol al 1% (peso/volumen) durante 24 horas a 110 °C de

acuerdo a la metodología de Rayner (1985). Después de la hidrolisis se filtraron las muestras atreves de un filtro de membrana de nylon de 0.2 micrones para remover los sólidos. El contenido del filtro se aforó a 25 ml con agua (grado HPLC) y una alícuota fue utilizada para la identificación del contenido de aminoácidos. Los aminoácidos en la muestra fueron derivatizados con dos reactivos, ortoftaldehido (OPA) y 9-Cloruro de fluorenilmetiloxicarbonil (FMOC), para los aminoácidos ácidos primarios y secundarios respectivamente. La separación de los aminoácidos ácidos se realizó mediante una columna (Zorbax Eclipse AAA, 4.6 x 150 mm and 3.5 µm) de fase invertida con un gradiente de fosfato de sodio di básico como fase móvil A y acetonitrilo como fase móvil B. La identificación de los aminoácidos totales fue realizada por un detector de matriz de diodos (DAD por sus siglas en inglés) a una longitud de onda de 338 nm para los aminoácidos primarios y 262 nm para los secundarios. La identificación y concentración de los aminoácidos fue estimada calculando el área de cada aminoácido relacionada a las curvas de calibración del estándar de aminoácidos.

3.3.8. Determinación del coeficiente de digestibilidad aparente

El coeficiente de digestibilidad aparente (CDA) de la lisina se determinó utilizando el método de cenizas insolubles en ácido clorhídrico descrito por (Montaño-Vargas et al., 2002). Para determinar el CDA de la lisina se utilizaron las siguientes formulas:

EL CDA (%) de lisina = 1 – [(% ceniza insoluble en dieta /% ceniza insoluble en heces) x (% lisina en heces /% lisina en dieta)] (9) La ceniza insoluble (CI) fue calculada de la siguiente manera:

CI (%) = ceniza insoluble (g) x 100 / muestra (g) (10)

3.3.9. Análisis estadístico

Los valores de la variables de crecimiento y utilización del alimento fueron analizados mediante un diseño completamente aleatorizados y se presentan como promedios (n = 3) ± desviación estándar (DE). Todos los datos fueron evaluados para normalidad mediante una prueba Komologorov-Smirnov y para homocedasticidad mediante una prueba de Levene. Subsecuentemente, se aplicó una prueba de análisis de varianza (ANOVA) de una vía para determinar si existía diferencias significativas entre los tratamientos,

y una prueba Tukey cuando se encontrara diferencias (P < 0.05). Las pruebas de Kologorov – Smirnov, Levene, ANOVA y Tukey, se realizaron mediante el programa STATISTICA® _{versión 7. Para estimar el}

requerimiento óptimo de lisina en la dieta, el coeficiente de crecimiento térmico fue modelado junto con la concentración de lisina en la dieta utilizando un modelo de análisis cuadrático “quadratic broken line” (y = L + U x (R – x) + V x (x – R) (Robbins et al., 2006). Realizado mediante el programa SAS® _{Studio versión.}