Metodolog´ıa del cultivo celular en interfase

confluencia, las c´elulas se disgregaban con tripsina (ver secci´on 8.3) y el sedimento celular se resuspend´ıa en el volumen adecuado, seg´un el n´umero de frascos que se ten´ıan que preparar y el d´ıa en que quisiera realizarse el experimento. Se utilizaban 2-8 frascos de cultivo con una superficie de 225 cm2. Se transfer´ıa una fracci´on de c´elulas a cada uno de los frascos y se a˜nad´ıa medio fresco hasta completar los 45 ml. La Tabla 8.1 muestra la relaci´on de frascos de cultivo empleados, su capacidad m´axima y el uso que se les daba.

Tabla 8.1: Tipos de frascos de cultivo empleados

Superficie Marca comercial Volumen medio Uso

25 cm2 _{Sarstedt 7 ml Establecimiento del cultivo}

75 cm2 Sarstedt 15 ml Mantenimiento del cultivo

225 cm2 Cultek 45 ml Expansi´on del cultivo

8.5.

Metodolog´ıa del cultivo celular en interfase

Para llevar a cabo un experimento para el estudio de la estructura de la croma- tina interf´asica, se preparaban cultivos celulares al 80 % de confluencia en frascos de 225 cm2 de superficie, tal como se explica en el apartado 8.4. Justo antes de empe- zar se comprobaba el estado de crecimiento y se valoraba la relaci´on entre c´elulas interf´asicas y metaf´asicas mediante un microscopio ´optico. Las c´elulas metaf´asicas pueden diferenciarse porque tienen un aspecto redondeado y est´an flotando en el me- dio de cultivo, adheridas a la superficie ´unicamente a trav´es de un ped´unculo. Las c´elulas interf´asicas, por el contrario, est´an completamente adheridas a la superficie y presentan un aspecto estrellado. Generalmente, las c´elulas interf´asicas supon´ıan el 80-90 % del total de c´elulas en el cultivo.

8.5.1. Aislamiento de c´elulas interf´asicas

Para poder estudiar la estructura de la cromatina interf´asica, era necesario eli- minar todas las c´elulas metaf´asicas presentes en el cultivo. Las c´elulas metaf´asicas pueden desengancharse f´acilmente de la superficie del frasco de cultivo ya que, como se ha indicado, est´an adheridas tan s´olo a trav´es de un ped´unculo. Para ello, se em- pleaba la t´ecnica de shake-off (Narayanswamy y Hamkalo, 1987; Caravaca, 2004), que consiste en golpear lateralmente el frasco, unas 10 veces por cada lado. A conti- nuaci´on, se eliminaba el medio de cultivo que conten´ıa la gran mayor´ıa de las c´elulas metaf´asicas. Se a˜nad´ıan 10 ml de PBS a cada frasco y se repet´ıa la operaci´on de

shake-off. Se comprobaba que el frasco no contuviera c´elulas metaf´asicas, y cuando era necesario se repet´ıa de nuevo la operaci´on. Una vez se hab´ıan eliminado todas las c´elulas metaf´asicas, se a˜nad´ıan 10 ml de PBS y se proced´ıa a desadherir las c´elulas interf´asicas con ayuda de unscraper (Sarstedt)1 _{de 25 cm de longitud, con el que se}

60 Cultivos celulares

iba barriendo la superficie del frasco. Con ayuda de una pipeta serol´ogica se dejaba caer el PBS por las paredes para arrastrar las c´elulas. El PBS con las c´elulas en suspensi´on se transfer´ıa a un tubo pl´astico est´eril de 15 ml de capacidad y se centri- fugaba a 200×gdurante 5 minutos en la centr´ıfuga Beckman Allegra 6R, empleando el rotor GH-3.8 (Beckman Coulter). A continuaci´on, se aspiraba el sobrenadante de cada tubo y se resuspend´ıan todos los sedimentos con 10 ml de PBS frescos. En este punto se realizaba un recuento celular, tal como se indica en el apartado 8.7. Al final, se hac´ıa un ´ultimo lavado, y se volv´ıan a centrifugar las c´elulas a 200×g

durante 5 minutos a 4 ℃. Se retiraba el PBS y se conservaba el sedimento de c´elulas interf´asicas. A partir de aqu´ı, la muestra se manten´ıa a 4 ℃ en todo momento.

8.5.2. Purificaci´on de n´ucleos interf´asicos

Figura 8.1: Esquema del gra- diente bif´asico empleado pa- ra la purificaci´on de n´ucleos.

La fase inferior se preparaba con tamp´on C (2.3 M sacarosa) y la su- perior conten´ıa la suspensi´on celu- lar en presencia de 1.62 M de saca- rosa.

El protocolo de aislamiento de n´ucleos ha sido di- se˜nado a partir del protocolo descrito por Rill et al. (1978). La composici´on de todos los tampones que se mencionan puede consultarse en la Tabla 9.1. El sedimento celular obtenido seg´un el protocolo deta- llado en el apartado 8.5.1 se resuspend´ıa en tamp´on A (2.7 ml por cada frasco de partida). Este tamp´on se complementaba, justo antes de su uso, con fluoru- ro de fenilmetanosulfonil (PMSF)2, un inhibidor de serina-proteasas. La suspensi´on de c´elulas era trans- ferida a un homogeneizador de vidrio tipo Dounce provisto de un pist´on de tefl´on. La muestra se pasa- ba por el pist´on 15 veces para conseguir la rotura de la membrana celular. El volumen de c´elulas recupe- rado se transfer´ıa a un tubo pl´astico c´onico est´eril de 50 ml que conten´ıa 2 vol´umenes de tamp´on B y se mezclaba por inversi´on.

El tamp´on de base en todas las soluciones em- pleadas en el aislamiento de n´ucleos era PM1X (Pi- pes 5 mM, NaCl 5 mM y MgCl2 5 mM). La separa-

ci´on de los n´ucleos del resto de material citoplasm´ati- co se llevaba a cabo por sedimentaci´on en un solo paso mediante un gradiente bif´asico de sacarosa (Fi-

gura 8.1). La soluci´on superior ten´ıa una concentraci´on de sacarosa de 1.62 M y un detergente i´onico3 que eliminaba la membrana nuclear externa y el material cito- plasm´atico asociado. La soluci´on inferior conten´ıa 2.3 M de sacarosa y era donde sedimentaban los n´ucleos. El gradiente se preparaba en tubos Ultra-Clear (Beckman Coulter) para ultracentr´ıfuga con una capacidad de 5 ml. En el fondo se depositaban 1.25 ml de tamp´on C y sobre ´este se a˜nad´ıan 3.75 ml de la suspensi´on de n´ucleos 2_{Se preparaba una disoluci´on stock de PMSF en isopropanol a una concentraci´on de 0.1 M. En}

cada experimento se a˜nad´ıa el volumen necesario de dicha soluci´on al tamp´on correspondiente.

3_{Este tamp´on es el resultante de mezclar un volumen de c´elulas en tamp´on A con 2 vol´umenes}