8. Cultivos celulares
10.4. M´etodos para la reconstrucci´ on tridimensional de placas metaf´ asicas
10.4.3. Procedimiento para la obtenci´ on de placas en gran cantidad
Los cromosomas purificados seg´un el apartado 10.2 se dilu´ıan 5 veces con el tamp´on PM. A continuaci´on, la suspensi´on se pasaba 1 o 5 veces a trav´es de una aguja hipod´ermica de 22G1 (Sigma-Aldrich) acoplada a una jeringa. Finalmente, los cromosomas parcialmente desestructurados se dializaban en saco (ver apartado 7.1.1) en presencia de 1 l de tamp´on PM durante 2.5 horas a 37 ℃. Acabada la di´alisis, la suspensi´on de placas se transfer´ıa a un tubo pl´astico est´eril de 15 ml, donde se conservaba a 4 ℃.
2El primer n´umero indica el di´ametro del agujero y el segundo el espaciado m´ınimo entre agujeros,
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M´etodos para el estudio de la estructura de la cromatina en los cromosomas metaf´asicos
10.4.4. Deposici´on de la muestra sobre rejillas para criomicroscop´ıa
Se han evaluado diversos protocolos de deposici´on, con el fin de favorecer la adhesi´on de una gran cantidad de placas sobre la superficie de las rejillas.
Por un lado, se han realizado curaciones de la suspensi´on de placas (ver apartado 10.4.3), sobre rejillas previamente activadas. Se a˜nad´ıan 200 μl de muestra en el interior de un tap´on con junta t´orica para tubos de polipropileno de 1.5 ml (Sarstedt). Los tapones se dispon´ıan sobre una hoja de Parafilm en hielo. A continuaci´on, se colocaba la rejilla con el carbono hacia arriba en el fondo del tap´on, y se cerraba el tubo manteniendo la posici´on invertida. Se permit´ıa la adhesi´on de la muestra durante 1, 2, 3, 4 o 16 horas a 4 ℃.
Por otro lado, tambi´en se ha aplicado el procedimiento convencional para la deposici´on de muestra sobre rejillas para TEM, esto es, centrifugar la muestra di- rectamente sobre Quantifoil activado (ver procedimiento en el apartado 7.3.5.2).
10.4.5. Adici´on de nanopart´ıculas de oro y vitrificaci´on de la muestra
Figura 10.4: Sistema de crio- fijaci´on de muestras Vitro- bot Mark III (FEI). Fuente: http://www.nuance.northwestern.edu
La vitrificaci´on de la muestra se realizaba por inmersi´on r´apida en agente criog´enico de forma automatizada mediante el sistema Vitrobot Mark III (FEI). Se empleaba una mezcla de etano y pro- pano como agente criog´enico, contenido en un pe- que˜no recept´aculo que se manten´ıa a muy baja temperatura gracias al nitr´ogeno l´ıquido que flu´ıa alrededor.
Inicialmente, se colocaban unos filtros circu- lares de papel Whatman en los discos del equi- po, que serv´ıan para retirar el exceso de muestra. A continuaci´on, la rejilla que conten´ıa la muestra previamente depositada por centrifugaci´on (ver apartado 10.4.4), se fijaba al robot por medio de unas pinzas de precisi´on. Se accionaba un pedal para que la rejilla descendiera hasta la altura en la que se encontraba la ventana por la que se intro- duc´ıa una micropipeta con 2μl de nanopart´ıculas de BSA-oro de 10μm de di´ametro (Aurion). Las nanopart´ıculas se depositaban sobre la muestra y se mezclaba suavemente. Acto seguido, se accio- naba el pedal sucesivamente hasta que la rejilla quedaba sumergida en el contenedor con el agen- te criog´enico. Para acabar, se transfer´ıa la rejilla
de forma manual a una caja almacenadora sumergida en nitr´ogeno y, finalmente, las cajas correctamente rotuladas se guardaban en tanques de nitr´ogeno l´ıquido. El proceso se realizaba a 22 ℃, 95 % de humedad, empleando un tiempo de secado de la rejilla de 6 segundos y manteni´endola en una posici´on vertical de -3 mm (blot
10.4 M´etodos para la reconstrucci´on tridimensional de placas metaf´asicas
mediante crio-TE 79
offset). Se obtuvieron mejores resultados en el proceso de vitrificaci´on sustituyendo uno de los discos secantes por un disco de tefl´on.
Era muy importante que durante el proceso de vitrificaci´on se conservara la atm´osfera formada en torno al recipiente que conten´ıa el agente criog´enico, evitando corrientes de aire y movimientos bruscos. Todos los instrumentos que se utiliza- ban en la manipulaci´on de las rejillas deb´ıan secarse previamente para retirar la humedad que se condensaba. Se deb´ıa minimizar al m´aximo la humedad de todos los recipientes y herramientas, para evitar la formaci´on de hielo cristalino en las preparaciones.
10.4.6. Adquisici´on de series de proyecciones
La crio-tomograf´ıa electr´onica se ha realizado empleando los microscopios electr´o- nicos de transmisi´on Tecnai G2 Polara (FEI) y Titan Krios (FEI). Este ´ultimo estaba equipado con una placa de fase Volta (FEI) (Danev et al., 2014), que permit´ıa au- mentar considerablemente el contraste y obtener, por consiguiente, reconstrucciones tridimensionales con mejor resoluci´on. El aumento del contraste permite obtener ca- da proyecci´on empleando una menor dosis electr´onica, por lo que se puede obtener un mayor n´umero de proyecciones para una misma dosis electr´onica total3. Adem´as, la incorporaci´on de dicha placa de fase aumenta el contraste en el plano de foco, por lo que no es necesario aplicar un enfoque negativo para generar contraste, como ocurre cuando no tenemos placa de fase.
Las im´agenes empleadas en la obtenci´on de reconstrucciones tridimensionales obtenidas sin emplear la placa de fase, se han adquirido mayoritariamente en el mi- croscopio Tecnai G2 Polara, con un voltaje de aceleraci´on m´aximo de 300 kV, filtro de energ´ıa GIF 2002 (Gatan) y equipado con una c´amara K2 Summit de detec- ci´on directa de electrones (Gatan). Se han adquirido series de proyecciones cada 2° mediante el programa SerialEM (que permite la automatizaci´on del proceso; Mas- tronarde, 2005), aplicando un enfoque negativo de 5-6 μm y empleando una magni- ficaci´on relativa de 27500×. El tama˜no de p´ıxel es 4.27 ˚A. Bajo estas condiciones, se han obtenido 7 series de adquisiciones.
Las im´agenes empleadas en la obtenci´on de reconstrucciones tridimensionales obtenidas empleando la placa de fase Volta, se han adquirido en el microscopio Titan Krios4, con un voltaje de aceleraci´on de 300 kV y equipado tambi´en con una c´amara Gatan K2 Summit. Se han adquirido series de proyecciones cada 2°5 mediante el programa SerialEM (Mastronarde, 2005), aplicando un enfoque negativo de 0.5μm y empleando una magnificaci´on relativa de 33000x. El tama˜no de p´ıxel es de 4.21 ˚A. En estas condiciones se han obtenido 26 series de adquisiciones.
3La dosis electr´onica ´optima era de 60 electrones/˚A2. Durante la adquisici´on de las series to-
mogr´aficas se toleraban hasta 100 electrones/˚A2.
45 de estos tomogramas se adquirieron en las mismas condiciones pero sin emplear la placa de
fase, aplicando un enfoque negativo de 7μm.
55 de las series de proyecciones se adquirieron siguiendo el esquema de ´angulos 1/coseno, que
incrementa la dosis electr´onica en los ´angulos m´as grandes, obteni´endose as´ı un mayor n´umero de proyecciones a mayores ´angulos.
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M´etodos para el estudio de la estructura de la cromatina en los cromosomas metaf´asicos
10.4.7. Reconstrucci´on tridimensional a partir de las series