Microscopia y cultivo

Los microorganismos deben estar dispersos en el fluido. Por medio de la observación directa con microscopio de contraste de fase o de campo oscuro, microscopia de escaneo de electrones o de citologías con tinción Gram, todos los tipos morfológicos presentes pueden detectarse, pero algunos no pueden recuperarse en los cultivos. La presencia de bacterias específicas puede evaluarse en citologías teñidas con la técnica inmunofluorescente indirecta.

Para su cultivo, las diluciones de la muestra dispersa se extienden en un medio agar que después es encubado lo suficiente de 10 a 14 días para permitir que hasta los que, tardan más en crecer, formen colonias.

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En un caldo de cultivo, las bacterias de crecimiento más rápido superan a las otras, y los miembros de una microflora combinada serán ignorados. El medio agar no selectivo con sangre hemolisáda cumple con muchos de los requerimientos de nutrientes y es más apropiado para cultivar muchos tipos bacterianos, así como las levaduras. Para propósitos científicos, se puede incluir medios selectivos, por ejemplo, agar de Sabouraud para levaduras, agar mitis salivarius para estreptococos o agar Rogosa SL para Lactobacilos.

Se requiere de medios especiales para el crecimiento de mícroplasmas y Espiroquetas, pero sólo algunas de las Espiroquetas son cultivables aun cuando se utiliza técnicas especiales. Los microorganismos que colonizan los conductos radiculares son anaerobios facultativos y obligados, por lo que las técnicas de manipulación e incubación de los cultivos son esenciales para obtener resultados precisos. Este requerimiento se puede cumplir usando campanas de anaerobiosis o mejor aún una caja anaeróbica en donde se lleva a cabo el trabajo con muestras y cultivos, así como la inoculación, en una atmósfera libre de oxígeno.

Para facilitar la identificación de las bacterias anaerobias facultativas y capnofílicas afines al dióxido de carbono, se incuba un conjunto de placas de agar en aire completando con dióxido de carbono.

Por lo general, una o dos colonias de cada tipo son sub- cultivadas para su identificación. Debido a que las diferentes bacterias pueden tener colonias similares, para algunos propósitos es mejor aislar un gran número de colonias, por ejemplo, 50 de una muestra.

3.4.4 MÉTODOS PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN. 3.4.4.1 Cultivos y diagnóstico microbiano molecular.

Los cultivos se basan en el crecimiento de microorganismos en el laboratorio en condiciones de crecimiento artificiales. Esta técnica tiene una ventaja de permitir identificar una gran variedad de especies microbianas en la misma muestra, incluyendo las que no se buscaban. Así mismo, permite determinar la susceptibilidad antimicrobiana de cepas aisladas. A pesar de los sorprendentes avances en el aislamiento e identificación de las bacterias anaerobias, los métodos de cultivo tienen destacados inconvenientes.

65 positivos.

 Los resultados diagnósticos son lentos.

 A menudo tiene baja especificidad y, por tanto, tiene considerables limitaciones en el momento

de distinguir entre especies y cepas microbianas.

 Tienen baja sensibilidad, especialmente con las bacterias anaerobias exigentes.

 Dependen estrictamente del modo en que se ha transportado la muestra, que puede permitirla

supervivencia de las bacterias anaerobias pero no favorecer el crecimiento excesivo de las bacterias facultativas.

 Consumen tiempo, son laborioso y caros.

En los últimos 20 años, para la identificación bacteriana se ha introducido métodos basados en la biología molecular. Estos métodos se fundamentan en que, en realidad, cada ser vivo, incluidos los microorganismos, tiene secuencias marcadas en su genoma que pueden utilizarse como dianas para identificarlas con precisión y clasificarlas filogenéticamente.

Los nuevos métodos de identificación bacteriana no dependientes de cultivos se han utilizado para determinar la diversidad bacteriana asociada a las zonas enfermas y sanas de los seres humanos.

Los estudios muestran que alrededor del 40 al 50 % de los clones bacterianos de la cavidad oral y casi el 70% de los clones del intestino delgado y el colon, representan especies desconocidas e incluso no cultivadas. Por tanto, es probable que algunos patógenos sin caracterizar existan en esta proporción no cultivables, existe una considerable proporción de especies microbianas no pueden crecer en condiciones de laboratorio. Los microorganismos pueden ser no cultivables por numerosas razones:

 El medio de cultivo artificia puede carecer de los nutrientes necesarios o de factores de crecimiento, ya que se conoce muy poco de los factores de crecimiento específicos que utilizan los microorganismos para sobre vivir en el organismo hospedador. El medio de cultivo, en sí mismo, puede ser tóxico para algunas especies e inhibir su crecimiento.

 Otros microorganismos de muestra pueden producir sustancias que inhiban las especies diana.

 Unas especies pueden depender de otras para su crecimiento .Por ejemplo, Tannerella

forsythia tiene absoluta necesidad del ácido N-acetilmurámico. Crece muy mal en cultivos puros pero bien en cultivos conjuntos son otras especies.

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cuales están influenciados por las condiciones medio ambientales. La separación de las bacterias en medios sólidos es probablemente por desorganización de estas intercomunicaciones, y explica la imposibilidad de cultivar estas especies

Obviamente, si los microorganismos no se pueden cultivar, tampoco se pueden identificar por métodos basados en el fenotipo. Las investigaciones se deben dirigir a métodos que se basen en la cultivabilidad de las bacterias.

Los métodos de diagnóstico molecular para los microorganismos tienen varias ventajas sobre los cultivos:

 Pueden detectar especies y cepas microbianas tanto cultivables como no cultivables.

 Tiene mayor especificidad.

 Pueden detectar especies microbianas directamente de las muestras clínicas, sin necesidad

de cultivarlas.

 Son más sensibles que otros métodos de identificación. Por ejemplo el método de PCR es

más sensible que cualquier otra prueba de diagnóstico microbiano.

 Normalmente consumen menos tiempo.

 No requieren condiciones anaeróbicas estrictas durante la toma y transporte de las muestras.

 Se pueden utilizar durante los tratamientos antimicrobianos.

 Cuando se deben analizar grandes cantidades de muestras en estudios epidemiológicos, se

pueden almacenar a baja temperatura y analizarse inmediatamente.

Para identificar los patógenos endodónticos se ha utilizado varios métodos basados en la biología molecular. Muchas metodologías moleculares se basan en el empleo del gen del ARN ribosómico (ADNr) para identificar microorganismos sin necesidad de cultivos. El gen 16s ADNr está presente en todas las bacterias; tiene algunas regiones que son virtualmente idénticas en todas las bacterias y otras regiones cuyas secuencias variables del gen 16s ADNr son las únicas marcas que permiten identificaciones específicas.