Modelos moleculares de receptores acoplados a proteínas G

membrana implicadas en la transmisión de señales extracelulares a través de neurotransmisores, péptidos o glicoproteínas con la mediación de la proteína G unida en el interior de la célula188.

184_{Jorgensen, W.L.; Tirado-Rives, J. J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 1657.} 185_{Véase nota 173.}

186_{Berendsen, H.J.C.; Postma, J.P.M.; van Gunsteren, W.F.; Hermans, J. Interaction} Models for Water in Relation to Protein Hydration. In Intermolecular Forces. Pullman, B., Ed.; Reidel: Dordrecht, 1981, pp 331-342.

187_{Jorgensen, W.L.; Chandrasekhar, J.; Madura, J.D.; Impey, R.W.; Klein, M.L. J. Chem.} Phys., 1983, 79, 926.

La dificultad de obtener la estructura cristalina 3D de alta resolución de la familia de GPCRs, a la cual el receptor 5-HT4 pertenece, explica el interés de la construcción de modelos computacionales de este sistema de receptores, a partir de los cuales sea posible inferir tanto la estructura como el mecanismo de acción del receptor189. Está aceptado que los GPCRs contienen un dominio amino terminal extracelular, un dominio carboxilo terminal citoplasmático y siete dominios transmembrana α-helicoidales antiparalelos conectados por bucles hidrofílicos. El considerable número de patrones de secuencia de aminoácidos conservados en los segmentos transmembrana de la rodopsina (RHO) con relación a otros miembros de la familia de los GPCRs, incluyendo la familia de receptores de neurotransmisores, sugiere que también existe una estructura conservada en los dominios transmembrana.

Inicialmente, la estructura 3D de la bacteriorrodopsina190 se utilizó como guía en la modelización de la estructura terciaria de varios receptores involucrados en la neurotransmisión191. Sin embargo, la proyección de la estructura de la RHO bovina, a una resolución de 9 Å, mostró que las hélices de la RHO están inclinadas de manera diferente a como se sitúan en la bacteriorrodopsina192. Un estudio posterior de criomicroscopía electrónica en cristales bidimensionales (2D) de RHO de rana permitió determinar por primera vez la inclinación de las siete hélices193. En este sentido, las coordenadas de los carbonos alfa (Cα) de las siete hélices de la RHO194, publicadas de acuerdo con los mapas de densidad electrónica193, representaban hasta hace poco la aproximación más fiable a la estructura 3D de la RHO. En Agosto de 2000 se ha publicado la esperada estructura cristalográfica de la RHO bovina195, con 2,8 Å de resolución (Figura 6). Esta estructura 3D ha proporcionado la disposición exacta de las hélices transmembrana (TMHs) en el interior de la membrana celular, constituyendo un modelo muy apropiado en la

189_{Ballesteros, J.A.; Weinstein, H. Methods Neurosci., 1995, 25, 366.}

190_{Henderson, R.; Baldwin, J.M.; Ceska, T.A.; Zemlin, F.; Beckmann, E.; Downing, K.H.} J. Mol. Biol., 1990, 213, 899.

191_{Hibert, M.F.; Trumpp-Kallmeyer, S.; Bruinvels, A.; Hoflack, J. Mol. Pharmacol., 1991,} 40, 8.

192_{Schertler, G.F.X.; Villa, C.; Henderson, R. Nature, 1993, 362, 770.}

193_{Unger, V.M.; Hargrave, P.A.; Baldwin, J.M.; Schertler, G.F.X. Nature, 1997, 389, 203.} 194_{Baldwin, J.M.; Schertler, G.F.X.; Unger, V.M. J. Mol. Biol., 1997, 272, 144.}

195_{Palczewski, K.; Kumasaka, T.; Hori, T.; Behnke, C.A.; Motoshima, H.; Fox, B.A.; Le} Trong, I.; Teller, D.C.; Okada, T.; Stenkamp, R.E.; Yamamoto, M.; Miyano, M. Science, 2000, 289, 739.

Figura 6. Estructura cristalográfica de la RHO bovina a una resolución de 2,8 Å.

modelización de la estructura 3D de la familia de GPCRs estructuralmente relacionados, si bien la homología estructural entre la RHO y otros GPCRs probablemente no se extiende al dominio extracelular.

Existen evidencias directas196 de la existencia de los GPCRs en equilibrio entre un estado inactivo y otro activo. En ausencia de un ligando extracelular, el estado inactivo es el que predomina, mientras que los agonistas se unen a la forma activa del receptor con mayor afinidad que a la inactiva, desplazando el equilibrio hacia su estado activo. Se ha sugerido que la orientación de la Arg3.50 (nomenclatura de Ballesteros y Weinstein197), situada en el motivo conservado denominado E/DRY de la transmembrana 3 (TMH 3), hacia la Asn1.50, Asp2.50, Asn7.49 y Tyr7.53, o hacia el citosol, junto con la desprotonación o protonación del Asp3.49 de la secuencia E/DRY, están relacionadas con la existencia del receptor en su forma activa o inactiva198. Sin embargo, la estructura 3D de la forma activa del receptor aún no se conoce ni siquiera a un nivel de baja resolución.

Las simulaciones de dinámica molecular, a partir de las secuencias de aminoácidos de los receptores endógenos y receptores mutados constitutivamente activos, permiten la construcción de modelos teóricos 3D de la estructura del receptor tanto en su forma inactiva como en la activa, respectivamente. Asimismo, la modificación de determinados aminoácidos de la secuencia de los GPCRs mediante métodos de biología molecular proporciona una interesante información acerca de los residuos claves para la unión, constituyendo a menudo un punto de partida ineludible para la construcción de los modelos moleculares de los complejos ligando-receptor199. Así, experimentos de mutagénesis llevados a cabo en GPCRs de aminas neurotransmisoras200 han puesto de manifiesto la importancia del residuo conservado de Asp3.32, en la TMH 3, en la unión ligando-

196_{(a) Samama, P.; Cotecchia, S.; Costa, T.; Lefkowitz, R.J. J. Biol. Chem., 1993, 268,} 4625. (b) Bond, R.A.; Leff, P.; Johnson, T.D.; Milano, C.A.; Rockman, H.A.; Mcminn, T.R.; Apparsundaram, S.; Hyek, M.F.; Kenakin, T.P.; Allen, L.F.; Lefkowitz, R.J. Nature, 1995, 374, 272.

197_{Véase nota 189.}

198_{(a) Scheer, A.; Fanelli, F.; Costa, T.; De Benedetti, P.G.; Cotecchia, S. EMBO J.,} 1996, 15, 3566. (b) Scheer, A.; Fanelli, F.; Costa, T.; De Benedetti, P.G.; Cotecchia, S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 808.

199_{Savarese, T.; Fraser, C. Biochem. J., 1992, 283, 1.}

receptor mediante la formación de un par iónico201 entre el carboxilato y el nitrógeno básico protonado del ligando. Asimismo, se han identificado series de residuos conservados de Ser o Thr (5.42, 5.43 y 5.46)200, en la TMH 5, que actúan como sitios de formación de enlace de hidrógeno en la unión de numerosos neurotransmisores que poseen grupos hidroxilo en su estructura química. Recientemente, se ha comprobado que estos residuos de Ser de la TMH 5 no sólo proporcionan un punto de interacción en la unión de agonistas al receptor, sino que están implicados también en el control del equilibrio conformacional del receptor entre la forma activa y la inactiva202. Adicionalmente, la estructura de rayos X de la RHO ha confirmado que, como en el modelo de Baldwin, la TMH 3 central está próxima a la TMH 5 en su extremo citoplasmático, estando bastante alejadas unas de otras en las proximidades de sus extremos extracelulares. Es en esta cara extracelular donde se esconde el sitio de unión de las pequeñas moléculas neurotransmisoras, entre el Asp3.32 y los residuos de Ser/Thr5.42, 5.43, 5.46 implicados en la unión.

201_{Almaula, N.; Ebersole, B.J.; Zhang, D.; Weinstein, H.; Sealfon, S.C. J. Biol. Chem.,} 1996, 271, 14672.